Quinadoline C——海南海桑内生真菌的一种新生物碱

郭志凯，盖翠娟，蔡彩虹，曾艳波，袁靖喆，梅文莉，戴好富

中国热带农业科学院热带生物技术研究所，农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南海口571101

海洋蕴藏了丰富的生物资源，是药物先导化合物的广阔来源．红树植物为自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落，通常生长在盐分高、氧气缺乏的特殊生态环境中．因此，红树林植物及其内生真菌为适应这一特殊生境，形成特殊的生理特性和代谢途径，已成为寻找新药源的重要资源库[1]．海洋微生物产次级代谢产物结构新颖，类型多样，尤其是许多具有较强生物学活性的小分子结构，如大环内酯类、生物碱类、肽类、萜类和醌类等，通过结构修饰等可能成为药物先导化合物的重要来源，而且其来源的特殊性，有利于解决可能的药源问题，是目前海洋天然产物研究的重点和热点．近年来，由于围海养殖、围海造地和砍伐等人为因素，中国红树林面积大为减少，许多珍贵红树树种濒临灭绝．海南海桑(Sonneratiahainanensis)为海南特有红树树种，仅分布于中国海南岛．XING等[2]曾对海南东寨港红树林自然保护区内的海南海桑内生真菌多样性及其种群的组织分布进行了研究；亦有研究者从海南海桑同属红树植物无瓣海桑、杯萼海桑和海桑内生真菌中发现了众多结构新颖的化合物[3-8]．本课题组对海南特有红树植物内生真菌次生代谢产物进行了研究，发现了许多结构新颖的活性分子[9-17]，近期又从海南海桑叶片中分离得到一株内生淡色生赤壳菌Bionectriaochroleuca， 从其次生代谢产物中也鉴定出了具有抗细菌抗真菌抗肿瘤活性的成分[18]．本研究分析一株海南海桑叶片内生曲霉菌Aspergillussp. HS02的化学成分，利用多种柱色谱技术从其发酵液的乙酸乙酯粗提物中分离纯化得到一个化合物1(图1)．根据高分辨质谱、一维和二维核磁共振波谱技术，将其结构鉴定为一个结构新颖的吲哚生物碱，命名为quinadoline C．同时利用滤纸片琼脂扩散法对其抗农业病原真菌活性进行了评价．

图1 化合物1的结构Fig.1 Chemical structure of compound 1

1 材料与方法

1.1 实验材料

高分辨电喷雾质谱(high resolution electrospray ionization mass spectroscopy, HRESIMS)数据由6210 TOF LC-MS质谱仪(Agilent，美国)测定；化合物的一维谱包括氢(1H)核磁共振谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)和二维谱包括异核单量子相关(heteronuclear single quantum correlation, HSQC)、异核多键相关(heteronuclear multiple bond correlation, HMBC)和氢-氢质子同核相关谱(1H-1H correlated spectroscopy,1H-1HCOSY)数据在德国Bruker公司Bruker DRX-600核磁共振波谱仪测定，以四甲基硅烷(tetramethylsilane, TMS)为内标，化学位移以δ表示；分析型薄层层析硅胶(GF254)和层析柱硅胶(200～300 μm)均购自青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20和ODS反相硅胶分别购自瑞典Pharmacia Biotech和日本京都Nacalai Tesque公司；实验中使用的试剂均为分析纯．

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的发酵

曲霉菌菌株Aspergillussp. HS02经土豆培养基平板活化，28 ℃培养4 d后直接将菌块接种于含有400 mL液体MEA(malt extract agar)培养基(麦芽提取物20 g/L、蔗糖20 g/L、蛋白胨1 g/L)的锥形瓶(1 000 mL)中，置于摇床120 r/min，28 ℃培养13 d．

1.2.2 化合物的分离和纯化

发酵结束后，将上述发酵物用4层纱布过滤除去菌丝体得到约20 L发酵液，经等体积的乙酸乙酯萃取3遍，减压浓缩得到3.2 g乙酸乙酯粗提物．该粗提物经减压硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇梯度洗脱得7个流份(体积比分别为100∶ 0、100∶ 1、100∶ 2、100∶ 4、100∶ 8、100∶ 16和0∶ 100)．流份2(氯仿-甲醇，体积比为100∶ 1，420 mg)经ODS反相硅胶柱层析，以甲醇-水(体积比分别为 40∶ 60、50∶ 50、60∶ 40、70∶ 30和100∶ 0)梯度洗脱得到5个流份，其中，第2个流份(甲醇-水体积比为50∶ 50)经Sephadex LH-20凝胶柱层析(体积比为1∶ 1的氯仿-甲醇为流动相)得到化合物1 (17.3 mg)．

1.2.3 抗农业病原真菌活性测定

体外抗农业病原真菌活性测定所采用的方法与文献[9,19]报道的方法一致．采用PDA(potato dextrose agar)培养基，对化合物1抗芒果炭疽病真菌和橡胶炭疽病真菌的活性进行了测定，供试质量浓度为10 mg/mL．

2 结果与讨论

化合物1，灰白色粉末，正源高分辨电喷雾质谱测其准分子离子峰质荷比m/z为526.207 0[M + Na]+，推出其分子式为C27H29N5O5([C27H29N5O5Na]+的计算值为526.206 6)， 计算其不饱和度为16．根据化合物1的1H-NMR、13C-NMR和DEPT135谱可以看出该化合物具有11个季碳(碳化学位移δC分别为 175.9、171.7、161.3、152.0、147.8、139.7、139.1、121.8、85.6、75.5和65.2)、4个甲基(δC为26.3、25.2、18.2和14.8)、1个亚甲基(δC为42.9)和11个次甲基(δC为135.5、130.3、128.5、128.2、127.4、125.5、125.4、115.9、79.7、53.1和35.0)信号峰．其中，δC为161.3、171.7和175.9的季碳显示该分子中有3个酰胺羰基存在，2个甲基(氢质子化学位移δH分别为1.42和1.34)连接在季碳上，2个甲基(δH为1.31和1.08)连在次甲基上；在化合物的1H-NMR谱低场区有9个氢质子信号(8.27, dd, 耦合常数J=7.8, 1.2 Hz; 8.04, 宽单峰(br s); 7.88, td,J=7.8, 1.2 Hz;δH=7.73, d,J=8.4 Hz; 7.60, td,J=7.8, 1.2 Hz; 7.43, d,J=7.8 Hz; 7.40, d,J=7.8 Hz; 7.32, td,J=7.8, 1.2 Hz; 7.09, td,J=7.8, 1.2 Hz)，其中1个为宽单峰，可能为酰胺键上的NH，另外8个芳香氢质子位于两个1,2-二取代苯环上；进一步通过HSQC谱可判断该化合物中还存在两个羟基，综合其氢谱和碳谱数据推断该化合物上还存在一个NH．

分析该化合物的1H-1H COSY谱(图2)中的相关信号可推断该分子部分结构片段：H-6与H-5和H-7存在相关，H-7与H-6和H-8存在相关，H-11与H2-12存在相关，H-19与H-18和H-20存在相关，H-20与H-19和H-21存在相关，H-23与H3-24和H3-25存在相关．进一步分析其HMBC谱相关信号可揭示该分子的结构：H-8与C-4和C-10存在相关，H-5和H-7与C-9存在相关，H-6和H-8与C-4存在相关；H3-25与C-2、C-23和C-24存在相关，H3-24与C-2、C-23和C-25存在相关，H-23与C-3、C-24和C-25存在相关，2-OH与C-2、C-3和C-23存在相关；1-NH与C-1、C-2、C-3和C-11存在相关，H-11与C-1、C-3、C-10和C-13存在相关，H-12与C-1、C-13、C-14和C-22存在相关，13-OH与C-12、C-13、C-14和C-22存在相关，H-14与C-12和C-13存在相关；H-21与C-13和C-17存在相关，H-18和H-20与C-22存在相关，H-19和H-21与C-17存在相关；上述结构片段连接整理后即可推出化合物1的平面结构，为新吲哚类生物碱．该化合物的结构与一个已报道化合物quinadoline A[20]的结构差别在于，化合物1上C-2与C-23的连接键为单键，C-2被羟基化．

依据该化合物的二维核磁实验包括HSQC、HMBC 和1H-1H COSY的结果，将其1H和13C-NMR数据归属如表1．

利用滤纸片琼脂扩散法，体外测定了该化合物对芒果、橡胶炭疽病真菌的抑制活性，遗憾的是该化合物在较高测试浓度下亦对供试病原真菌无平板抑制活性．

结 语

生物碱具有多样的化学结构，其中，吲哚类生物碱是迄今发现最多的一类．生物碱具有多样的生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗寄生虫和镇痛等．生物碱主要产生于植物，如长春花中含有的抗癌单萜吲哚类、双吲哚类生物碱，但在微生物也会大量产生，尤其是真菌，如麦角菌属真菌产生的麦角碱类毒素．本研究对一株海南特有红树植物海南海桑叶片内生曲霉菌Aspergillussp. HSO2的次生代谢产物进行了研究，从其发酵液的乙酸乙酯粗提物中分离纯化得到一个新吲哚生物碱quinadoline C，该化合物的结构与已知吲哚生物碱quinadoline A相似，quinadoline A是KOYAMA等[20]从一株曲霉菌Aspergillussp. FKI-1746的发酵产物中分离得到，同时还报道分离到另一个新吲哚生物碱quinadoline B．2016年，RAJACHAN等[21]从土壤真菌NeosartoryaspinosaKKU-1NK1的菌丝体中也分离得到quinadoline A．quinadoline A和B对大鼠巨噬细胞中的脂滴合成具有较强的剂量依赖型抑制活性，表明该类化合物具有降脂或降低动脉粥样硬化发生风险的作用，因此该类化合物可能具有很好的开发应用前景．

表1 化合物1的1H 谱(600 MHz)和 13C谱(150 MHz)核磁共振数据(测试溶剂为氘代丙酮)