盐藻microRNAs高通量测序和生物信息学分析

娄素琳，朱秀兰，曾志勇，李 辉,4，胡章立,4

1) 深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳 518060；2) 深圳大学光电工程学院，光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室，广东深圳 518060；3) 广东省植物表观遗传学重点实验室,广东深圳 518060；4) 深圳大学龙华生物产业创新研究院，深圳市海洋藻类生物工程技术研究中心，广东深圳 518060

杜氏盐藻(Dunaliellasalina)也称盐藻，是一种生长于海水或高盐环境的单细胞光合绿藻，长约14～22 μm，宽约3～14 μm，无细胞壁，有两条鞭毛可游动．盐藻属于极端生物，可适应高盐、高光、低温和低pH值等极端环境，是研究植物耐高盐分子机制的重要模式生物．盐藻细胞营养丰富，含有大量类胡萝卜素和甘油，β-胡萝卜素含量最高，质量分数可达干质量的14%，商业价值极高[1]．盐藻基因组草图拼接数据(Dunaliellasalinagenome sequencing project)已于2017年公布(http://phyto zome.jgi.doe.gov/)[2]，为本研究探索盐藻非编码小核糖核酸(micro ribonucleic acid, microRNA 或miRNA)提供了参考．miRNA是一类内源性长约21～22个核苷酸碱基(nucleotide, nt)的非编码小RNA，通过碱基互补配对的方式介导靶mRNA的降解或阻遏靶mRNA的翻译，从而对基因表达进行转录后调控．miRNA于1993年首次在线虫体内被发现[3]，2007年首次在低等单细胞莱茵衣藻中被发现[4-5]．这让人们意识到miRNA很可能是一种古老的调控机制，且比多细胞的出现更早．2011年，胡章立等[6]分离鉴定到一些硫胁迫相关miRNAs．近年来，在低等生物团藻、三角褐指藻和微拟球藻中相继发现有miRNA存在[7]．本研究利用Illumina HiSeqTM2500高通量测序方法对盐藻进行miRNA测序，探究单细胞微藻是否普遍存在miRNA．

1 材料与方法

1.1 藻株和培养条件

盐藻藻株购自英国(https://www.ccap.ac.uk/)．盐藻培养基为RAMARAJ，培养条件为25 ℃，光照强度为50 μmol·m-2·s-1．盐藻置于恒温光照培养箱培养至对数生长期，收集藻细胞用于总 RNA提取．

1.2 小RNA的分离和cDNA文库的构建

用TRIzol提取盐藻总 RNA，琼脂糖凝胶电泳切胶选择18～30 nt的片段作为小RNA测序．分别连接3′和5′接头，进行反转录和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增．回收并纯化约140 bp的条带，完成文库构建．使用2100 TOF LC-MS质谱仪(Agilent，美国)及定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)进行质控，并上机测序．

1.3 盐藻miRNA的鉴定和靶基因预测分析

下机数据经初步过滤，得到用于后续分析的小RNA clean tags序列．比对GenBank、Rfam数据库及盐藻参考基因组数据，筛选后的clean tags同miRBase中已知的植物或动物miRNA进行比对，鉴定得到已知miRNA．结合盐藻基因组序列，进行发卡结构预测，鉴定得到新的miRNA．

使用RNAhybrid(v2.1.2)+svm_light(v 6.01)、Miranda(v3.3a)和TargetScan(version: 7.0)3种方法进行靶基因预测，然后取3种方法得到的靶基因预测的结果的交集作为miRNA靶基因预测的结果．

2 结果与分析

2.1 盐藻miRNA的测序信息分析

对盐藻小RNA原始下机数据，通过过滤中低质量、不带3′接头、含有5′接头、不含插入片段和插入片段长度小于18 nt，以及含有polyA的reads，得到盐藻小RNA clean tags序列11 542 169条，数据质量良好，用于后续分析. 比对GnenBank数据库、Rfam数据库及杜氏盐藻的参考基因组(包括内含子、外显子和重复序列)，3个生物学重复的盐藻clean tags注释统计分析如表1(取3者平均值)，没有比对上任何注释信息的tags为unann．

比对miRBase数据库和筛选后的clean tags数据，3个生物学重复获得盐藻已知miRNA 分别为42、41和44个．比对盐藻参考基因组及其miRNA前体发卡结构预测，3个重复分别获得盐藻新的miRNA 920、880和957个.

表1 盐藻小RNA测序的tags丰度统计

2.2 盐藻miRNA靶基因富集分析

对盐藻所有miRNA进行靶基因预测分析，并对靶基因进行GO功能分析和KEGG Pathway分析．对靶基因进行功能注释和归类，功能富集分析发现，靶基因主要集中在细胞代谢进程(约450个靶基因)、分子功能的结合(约500个靶基因)和催化活性(约500个靶基因)等生物途径，说明盐藻miRNA活跃参与调节这几个途径的基因表达．

3 讨论

本研究在杜氏盐藻中发现miRNA的存在，不仅丰富了人们对微藻miRNA的认识，也为揭示miRNA这一古老调控机制广泛存在于低等单细胞微藻提供了依据，为后续研究miRNA是如何调控盐藻积累β-胡萝卜素的分子机制研究奠定了基础.关于盐藻miRNA靶基因的预测，本研究结合了动植物两套模式来预测，因为最新的研究表明微藻和动物类似，miRNA的种子序列与靶基因配对就足以导致靶基因表达抑制[8]．后续的研究将对靶基因进行RT-PCR和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)实验验证．