奶牛结核病检测方法研究进展

（唐山市动物疫病预防控制中心，河北唐山 063000）

奶牛结核病是由牛分枝杆菌或结核分枝杆菌引起的重要人畜共患病，严重危害公共卫生安全、阻碍畜牧业生产和经济发展，目前被列为国家二类动物疫病。对于规模化奶牛场来说，全面实施“监测、淘汰、消毒”等综合防控措施，是预防、控制和净化奶牛结核病的有效途径，因此，快速准确的检测方法对该病的净化至关重要。本文对奶牛结核病常用检测方法进行简要概述，便于为控制和最终净化该病提供检测技术支撑。

1 常用检测方法概述

1.1 细菌学检测方法

1.1.1 涂片-染色-镜检

一般采用直接抹片方法，用萋-尼氏染色法进行染色，镜检观察，抗酸杆菌会呈现特征性的红色，其他细菌和细胞为蓝色。此方法检测分枝杆菌比较快速，但灵敏性及特异性较低。

1.1.2 细菌的分离及培养

常用罗杰二氏培养基、改良罗杰二氏培养基、丙酮酸培养基和小川培养基等选择性培养基进行分离，由于该菌生长缓慢，一般10～30d才能看到菌落，一般呈现粗糙、隆起、不透明、边缘不整齐，乳白色或米黄色的颗粒、结节或花菜状[1]。该方法对操作者的实验技能要求较高，而且周期过长，实际工作中很少被采用。

1.2 免疫学检测方法

1.2.1 结核菌素皮内试验

该方法自1899年建立以来，人们就一直利用它来检测牛结核病[2]。该方法主要使用提纯的牛型结核菌素对牛进行皮内注射，一般剂量为0.1ml，作用72h后观察注射局部及周围有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，通过注射前后皮皱厚度差来判定结果。该方法检出率和准确率都比较高，被列为牛结核病检疫的标准方法，但由于各分枝杆菌存在相互交错的变态反应，经常造成非特异性反应，使该方法的特异性大为降低[3]，同时，该方法需要消耗大量人力，且检测周期较长，不适用于大规模流行病学调查。

1.2.2 血清学检测

常用ELISA和胶体金方法检测牛结核抗体，吴位珩等[4]采用胶体金检测方法对贵阳省309头奶牛进行牛结核病检测，同时用结核菌素皮内试验作对比，结果两种方法阳性符合率为75%，阴性符合率93.54%，另种方法的差异极不显著，该方法便捷、快速，对操作人员、环境等要求不高，适合基层兽医对牛结核病进行普查和检疫，但在临床应用中，相对成本较高。陈萍等[5]采用皮内变态反应和 ELISA 两种方法对枣庄市中区333头奶牛进行结核病检测，并对两种检测方法进行了比较研究，两者初检符合率98.5%，复检符合率100%，但该研究中333头奶牛全为阴性，对于阳性检出率有待商榷。

血清学检测方法存在的主要问题是结核菌的抗原性较弱且种属间抗原决定簇与结核病的相关性还有待进一步研究，使血清学检测方法难以取得实质性的进展。

1.2.3 γ-干扰素ELISA检测方法

随着结核病和免疫学机制研究的进一步深入，发现当感染牛获得的致敏淋巴细胞再次遇到牛提纯结核菌素时，致敏淋巴细胞会释放大剂量的γ-干扰素，因此，可以通过ELISA方法检测γ-干扰素来判定牛是否感染结核病，称之为γ-干扰素ELISA检测方法。

廖娟红[6]、尹天燕[7]分别研究了利用γ-干扰素检测技术检测奶牛结核的方法，研究结果显示此检测技术准确度、特异性都好于PPD 变态反应诊断技术。徐贤坤等[8]运用皮内变态反应和γ-干扰素ELISA检测方法对广西5478头奶牛和1580头水牛进行牛结核病流行病学调查，并对两种检测方法进行对比，发现γ-干扰素ELISA检测牛结核病阳性率低于皮内变态反应，准确度高。

1.3 分子生物学检测方法

近年来，国内外学者在牛结核病的诊断和检测方法方面进行了大量研究，在病原学检测方面也建立了一些 PCR 诊断方法，刘思国等[9]根据已经发表的牛分枝杆菌的基因序列，设计引物可扩增 294bp目的片段，建立了特异性检测牛分枝杆菌的 PCR方法，该方法特异性强，敏感度可达到50pg，与PPD皮内试验比较，阳性样品符合率为90%，阴性样品符合率为 100%，但该方法对操作人员、环境要求较高，成本大，只适于个案的诊断，不适于大规模的活畜检测。

2 结语

国内由北京出入境检验检疫局和中国动物卫生与流行病学中心通过“Bovigam® IFN-γAssay 试剂盒”验证项目，充分肯定了该技术的先进性和可靠性，但鉴于γ-干扰素试验在国内的应用尚处于初级阶段，在临床上，最合适的方法是先用皮内变态反应的方法检疫牛群，再结合γ-干扰素ELISA检测进行综合判断，尽量避免因没必要的强制扑杀造成的经济损失，更有利于牛结核病的检测与净化。