转CmTre1基因RNA干扰水稻的室内和田间抗虫性鉴定

夏浪 杜娟 李尚伟 赵凤

摘 要：稻纵卷叶螟是一种主要的水稻害虫，海藻糖酶是昆虫几丁质合成通路上的关键酶之一。该研究对转稻纵卷叶螟可溶性海藻糖酶基因（CmTre1）双链RNA（dsRNA）水稻进行了室内和田间抗虫性鉴定。叶片测定结果表明，取食转CmTre1基因dsRNA水稻株系608的稻纵卷叶螟死亡率为70.00%，校正死亡率为50.95%。定量PCR检测表明，幼虫取食608株系后其体内CmTre1基因的mRNA水平下降59.00%，该基因的表达被抑制。田间抗虫性检测结果表明，608株系的卷叶率为15.06%，白叶率为13.98%，与对照差异显著。转CmTre1基因RNA干扰（RNAi）水稻对稻纵卷叶螟具有抗性。该研究为利用RNAi技术对稻纵卷叶螟进行绿色防控奠定基础。

关键词：稻纵卷叶螟；海藻糖酶；RNA干扰；抗虫性

中图分类号：Q966

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）03-0074-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.013

Indoor and Field Identification of Insect Resistant of CmTre1-transgenic RNAi Rice

XIA Lang，DU Juan， LI Shangwei*， ZHAO Feng

（Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region， Institute of Entomology， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550002 China）

Abstract：：The rice leaf folder， Cnaphalocrocis medinalis， is a major rice pest. Trehalase （Tre） is one of the key enzymes in the chitin synthesis pathway of insects. In this study， we identified the insect resistance of rice that was introduced the double-stranded RNA （dsRNA） of soluble trahalase gene from C. medinalis （CmTre1） indoors and in the fields. Results of leaf assay showed that mortality rate of C. medinalis fed on the dsRNA-transgenic rice line 608 was 70.00% and the corrected mortality rate was 50.95%. Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） analysis demonstrated that mRNA level of CmTre1 in C. medinalis fed on rice 608 dropped by 69.00%， and the expression of CmTre1 gene was inhibited. Results of insect resistance test in the fields indicated that the average rate of rolled and white leaves for rice 608 was 15.06% and 13.98%， respectively， which was significantly different from the control. The CmTre1 dsRNA-transgenic rice was resistant to C. medinalis. This study would lay the foundation for the green control of C. medinalis using RNA interference （RNAi） technology.

Key words：Cnaphalocrocis medinalis； trehalase； RNA interference； insect resistance

稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）是水稻的主要害虫之一，对该害虫的有效防治是保证粮食安全生产的重要问题。目前，在稻纵卷叶螟防治工作中仍以化学杀虫剂为主要手段，然而长期大量使用化学农药会造成一系列问题，如环境污染、对非靶标生物有负面影响以及害虫产生抗药性等[1]。因此，人們急需寻找一种新型杀虫方法来防治稻纵卷叶螟。

海藻糖是昆虫血淋巴中主要的糖类物质，海藻糖酶可将一分子海藻糖分解为两分子葡萄糖。昆虫海藻糖酶根据是否存在跨膜结构，可分为两类：可溶性海藻糖酶（soluble trehalase，Tre1）与膜结合型海藻糖酶（membrane-bound trehalase，Tre2）[2]。可溶性海藻糖酶分解细胞内海藻糖，而膜结合型海藻糖酶分解胞外（主要为食物中）海藻糖[3]。第一个可溶性海藻糖酶基因于1992年从黄粉虫（Tenebrio molitor）中被克隆[4]，主要在中肠、马氏管和卵巢中表达。膜结合型海藻糖酶基因，直到2005年才从家蚕（Bombyx mori）中获得[5]，主要在脂肪体、中肠和马氏管中表达。研究表明，多数昆虫体内都存在一个膜结合型和一个可溶性海藻糖酶基因，仅少数昆虫如异色瓢虫（Harmonia axyridis）[6]和褐飞虱（Nilaparvata lugens）[7]中找到多种可溶性海藻糖酶基因。海藻糖酶在昆虫几丁质合成与能量代谢过程当中扮演着十分重要的角色。因此，越来越多的科研工作者把海藻糖酶作为害虫防治的一个理想靶标。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（dsRNA）诱发的转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[8]，具有特异性和高效性。RNAi技术可被用于探索基因功能、肿瘤治疗及生物防治等方面。研究发现大多数昆虫都具有系统性RNAi，对某些昆虫如赤拟谷盗（Tribolium castaeum）和蟋蟀（Gryllus bimaculatus）的亲本实施RNAi，在其子代中仍可观察到基因沉默现象[9-10]。

本实验室通过转基因技术将稻纵卷叶螟可溶性海藻糖酶基因CmTre1的双链RNA （ds RNA）导入到水稻中，培育了转CmTre1基因RNAi水稻。本研究是以这些水稻株系为研究对象，在室内和田间鉴定其抗虫性，以期为利用RNAi技术对稻纵卷叶螟进行绿色防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与水稻

供试水稻材料为转CmTre1基因dsRNA的中花11。供试昆虫为稻纵卷叶螟幼虫，饲养条件为 26±1℃，相对湿度70%～80%，光周期14L∶10D。

1.2 主要试剂与仪器

HP Total RNA Kit购自美国 Omega Bio-tek 公司；大肠杆菌Escherichia coli TOP10感受态细胞、DL2000 DNA marker、PrimeScript RT-PCR Kit 、LA Taq DNA聚合酶均购于大连 TaKaRa公司；PCR仪（C1000 Thermal Cycler）和iTaq Universal SYBR Green Supermix 采购于美国 Bio-Rad 公司；离心管、PCR耗材及其他常规试剂与耗材均购自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 总RNA提取和cDNA合成

取稻纵卷叶螟3龄幼虫50～100 mg，液氮研磨后，用HP Total RNA Kit（Omega）提取总RNA，具体过程按照说明书进行操作，用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分别检测总RNA的完整性和纯度。按照 采用PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa）试剂盒将提取的总RNA反转录合成第一链cDNA。

1.4 荧光定量PCR引物设计

利用 Primer 6.0 针对稻纵卷叶螟CmTre1基因的编码区设计荧光定量 PCR （RT-qPCR）引物 CmTre1q-F 和 CmTre1q-R（表 1），检测RNAi后稻纵卷叶螟体内CmTre1的mRNA表达水平。以稻纵卷叶螟看家基因CmActin（GenBank登录号：JN029806）为内参对照。

1.5 室内抗虫性检测

用叶片测定法进行RNAi水稻的室内抗虫性鉴定。将直管（12 cm × 3 cm）一端用包裹有棉花的细纱布封口，分别剪取3个转CmTre1基因dsRNA水稻株系（605、608和622）的 5 片叶放入不同的直管中。每管接15头稻纵卷叶螟3龄幼虫，每隔 12 h，观察记录幼虫取食、表型及存活情况。每天定时在直管两端喷洒保鲜液，3 d更换一次叶片，7 d后统计死亡率，用存活的幼虫进行RT-qPCR检测。 死亡率计算公式：死亡率=死亡虫数/总虫数；校正死亡率计算公式：校正死亡率=（实验组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）。设3次重复，以正常水稻叶作为对照。

1.6 CmTre1基因沉默效应检测

稻纵卷叶螟取食转 CmTre1 基因dsRNA水稻叶片7 d后，分别收集实验组和对照组各2头存活的幼虫，提取总RNA，反转录合成第一链cDNA，然后以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测。PCR反应体系：1 μL cDNA，20 μmol/L上/下游引物各0.5 μL，10 μL 2× iTaq universal SYBR Green supermix （Bio-Rad），补加灭菌水到总体积20 μL。反应参数：95℃预变性1 min；95℃变性10 s，55℃ 退火20 s，72℃延伸30 s，进行40个循环。采用CFX Manager软件（Bio-Rad）进行实验数据记录与分析。

1.7 田间抗虫性检测

将转CmTre1基因dsRNA水稻株系以小区块种植，选35株罩上尼龙网，至分蘖盛期在每个网中的水稻上人工接种50头稻纵卷叶螟低龄幼虫，每隔7 d观察一次，30 d后统计水稻的卷叶率和白叶率。平均每株卷叶率=卷叶数/网中水稻叶片总数/35；平均每株白叶率=白叶数/网中水稻叶片总数/35。每个处理重复3次，以正常水稻作为对照。

1.8 数据与分析

采用 2-ΔΔCt法分析稻纵卷叶螟取食转CmTre1基因dsRNA水稻叶片后，其体内CmTre1基因的mRNA相对表达量。结果以平均值±标准差表示，根据数据绘制柱形图。采用SPSS 22统计软件中方差分析（ANOVA）的Duncan氏新复极差法进行多重比较检验，显著性检验水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 取食情况及表型观察

在接虫 2 d和 4 d后，观察稻纵卷叶螟的活力，通过其对水稻的取食情况判断其生命活力强度。用转CmTre1基因dsRNA水稻叶片饲喂稻纵卷叶螟 2 d后，可以清楚地看到，实验组和对照组的水稻叶片没有明显的差别，表明稻纵卷叶螟活力差不多；饲喂 4 d后，对照组水稻叶片被取食十分严重，而实验组水稻叶片并没有明显的变化（图1），说明稻纵卷叶螟在取食了RNAi水稻叶片后其生命活力明显受到抑制。接虫 7 d后，有的蟲体变黄，活动缓慢，部分虫体畸形发育，有的还出现死亡现象；不能正常化蛹，有些在化蛹期间死亡，只有极少部分能化蛹，但是蛹比较小，活力较低（图2）。

2.2 室内抗虫性鉴定

在直管中接虫7 d后，取食转CmTre1基因dsRNA水稻株系605、608和622的稻纵卷叶螟死亡率分别为60.00%、70.00%和66.67%，校正死亡率分别为 31.27%、50.95% 和43.49%，与对照组（701）相比差异显著（表2）。结果表明，转CmTre1基因dsRNA水稻对稻纵卷叶螟具有致死效应，株系608具有较好的抗虫效果。

2.3 CmTre1基因mRNA表达水平

实时荧光定量PCR结果显示，稻纵卷叶螟 3 龄幼虫取食转 CmTre1 基因dsRNA水稻叶片7 d 后，其体内可溶性海藻糖酶基因的表达水平相比对照组明显下降；取食605、608和622后，该基因的mRNA表达水平分别下降了55.00%、59.00%和48.00%，与对照组差异显著（图3）。

2.4 田间抗虫性鉴定

在田间人工接虫 30 d后，转CmTre1基因dsRNA水稻株系605、608和622的卷叶率分别为 12.20%、15.06%和14.81%，相较于对照，分别减少了11.50%、8.64%和8.89%；白叶率分别为11.43%、13.98%和13.20%，相对于对照，分别减少了11.22%、8.67%和9.45% （表3）。田间与室内抗虫性鉴定结果基本一致，稻纵卷叶螟幼虫选择性拒食RNAi水稻，利用RNAi技术防治稻纵卷叶螟具有一定的效果。

3 结论与讨论

海藻糖酶是昆虫能量代谢中的一类酶，也是昆虫几丁质合成通路中的第一个酶，它参与昆虫生长发育、蜕皮及繁殖等许多重要生理过程[12-13]。可溶型海藻糖基因对昆虫表皮几丁质合成影响更大，而膜结合型海藻糖酶基因影响中肠几丁质的合成[14-15]。在褐飞虱中，TRE的dsRNA能够有效地抑制海藻糖酶基因mRNA的表达，影响几丁质的合成与降解，从而导致几丁质含量下降、蜕皮困难及死亡[16，17]。在东亚飞蝗中，LmTre-1的mRNA 表达特性与几丁质合成酶1 基因非常相似，结果表明该基因可能与体壁几丁质的合成相关[18]。本研究对转CmTre1基因dsRNA水稻进行了室内和田间的抗虫性鉴定，从总体来看，株系608的抗虫性较好一些。该株系仅仅是导入了CmTre1基因dsRNA，下一步我们计划在水稻中同时导入稻纵卷叶螟2个海藻糖酶基因和2个几丁质合成酶基因的dsRNA，以期当该害虫取食这些转基因RNAi水稻时其体内这2类基因都被沉默，实现对该害虫的生物防治。

目前，利用植物介导的RNAi技术，让昆虫取食植物中表达的来自昆虫重要功能基因的dsRNA来实现对昆虫重要基因沉默方面的研究越来越多。Baum等[19]通过植物介导的昆虫肠道特异基因的RNAi技术成功获得了对根萤叶甲（Diabrotica virgifera）有抗性作用的转基因抗虫性玉米，这种方法很大程度上推动了转基因RNAi作物抗虫的研究进展。Mao等[20]利用转基因技术在烟草和拟南芥中表达了靶向棉铃虫（Helicoverpa armigera）细胞色素P450基因CYP6AE14的dsRNA，当棉铃虫进食转基因植物后，CYP6AE14的表达水平显著下调，幼虫生长发育受阻。Zha等[21]将褐飞虱（Nilaparvata lugens） 中肠里高表达的3个基因NlHT1、Nlcar 和Nltry 转入到水稻中，在水稻中表达它们的dsRNA，褐飞虱取食后，这3个基因均有效地被沉默。这些研究结果表明，我们可以应用转基因RNAi技术沉默害虫重要功能基因，培育抗虫作物新品种，实现对害虫的绿色防控。

参 考 文 献：

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