酶法制备竹笋壳微晶纤维素及其理化性质分析

魏成前 苏伟 宋玉 母应春于沛

摘 要：采用纤维素酶酶法制备竹笋壳微晶纤维素，以加酶量、酶解时间、温度、酶解pH为单因素实验，在此基础上用L9（34）正交试验优化纤维素酶解法制备竹笋壳MCC的工艺条件，将制备出的竹笋壳微晶纤维素与“新望”商品微晶纤维素对比其溶胀性、流动性、持水性及形态结构。结果表明，制备竹笋壳MCC的最优工艺条件为：加酶量1.2%，酶解时间50min，酶解温度53℃，酶解pH值为5。用扫描电镜观察竹笋壳微晶纤维素形态结构，通过理化分析，并与商品微晶纤维素对比，竹笋壳微晶纤维素与商品微晶纤维素特性基本保持一致。

关键词：酶法制备；竹笋壳；微晶纤维素；理化性质

中图分类号：TQ352.79

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）03-00 -0 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.001

Preparation of Microcrystalline Cellulose from Bamboo Shoot Shell by Enzyme Hydrolysis Method and Analysis of Its Physicochemical Properties

WEI Cheng-qian，SU Wei，SONG Yu，MU Yingchun*，YU Pei

（School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiyang， Guizhou， 550025，China）

Abstract：Cellulase enzymatic method was used to prepare Microcrystalline Cellulose （MCC） from bamboo shoot shell. The enzyme addition， enzymatic hydrolysis time， temperature， the ratio of solid to liquid and pH were taken as the single factor experiments. Based on this， the L9 （34） orthogonal test was used to optimize the enzymatic hydrolysis conditions for bamboo shell MCC preparation. The preparation conditions of the bamboo shoot shell MCC were compared， and the swelling， fluidity， water-holding capacity and morphological structure of the MCC from bamboo shoot shell were compared with those of the ‘xinwang’commercial microcrystalline cellulose. The results showed that the optimal conditions for the preparation of bamboo shoot MCC were as follows： the enzyme amount was 1.2%， the enzymolysis time was 50min， the enzymolysis temperature was 53℃， and the pH of enzymolysis was 5. Scanning electron microscopy （SEM） was adopted to observe the morphological structure and analyze the physicochemical property of MCC from bamboo shoot shell. Through physical and chemical analysis， and compared with commercial MCC， the characteristics of the bamboo shoot microcrystalline cellulose and commercial microcrystalline cellulose were basically consistent.

Key words：enzymatic preparation； bamboo shoot shell； MCC； physicochemical property

微晶纖维素（Microcrystalline Cellulose，MCC）是一种达到一定聚合度的纯化白色无味的由多孔微粒组成的结晶粉末状物质[1]。它广泛运用于制药、化妆品及食品领域，由天然纤维素经过酸水解或者酶水解制得，以β-1，4-葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质为主要成分，不溶于水、有机溶剂，是一种安全的食品添加剂。在我国GB2760-2011《食品添加剂使用标准》中被列为可按需使用的食品添加剂[2]：作为一种功能性纤维，MCC具有诸多作用，如作为吸附剂、稀释剂、抗结剂、乳化剂、分散剂、黏合剂、营养补充剂和增稠剂，也有提高液体的稳定性，保持乳化及泡沫稳定性的作用[3-4]。第八次全国森林资源清查结果显示，我国竹林面积共601万公顷，比上一次清查增长11.69%[5]。我国是竹笋的种植生产古国，《诗经》中古人就有食笋的记载，戴凯对竹笋做了初步的研究，并著有《笋谱》，它是全世界第一部竹笋资料[6]。但长期以来对竹笋的研究主要还是栽培贮藏保鲜及初加工阶段，很少对竹笋壳有进一步的开发与应用。竹笋加工过程中会产生一定量的笋头、笋壳以及废弃液，处理不当就会造成环境污染。

制备MCC的原料有稻壳、小麦、稻草、豆渣等[7]。竹笋壳是竹笋加工过程中的副产物，其中含纤维素41.66%，半纤维素28.11%，木质素20.35%，果胶0.82%，脂蜡质1.33%，水溶物7.73%[8]，是制备食品MCC的良好原料。传统的微晶纤维素生产工艺路线是采用酸进行高温水解，然后漂白，再进行洗涤干燥，经粉碎即得[9-10]。这个水解过程要求苛刻，需要消耗强酸强碱等化学品，并且会产生糠醛酚类等有毒气体，对环境造成污染。而用纤维素酶法制备MCC，具有污染小及制备过程安全等优点。纤维素酶是一类将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖及纤维糊精等一系列复杂酶系的总称，分为葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶[11]。此实验运用葡萄糖内切酶随机水解纤维素处于无定形区的分子链，形成纤维素结晶分子，最终水解制得极限聚合度的微晶纤维素[12-13]。根据之前已有的研究报导，吕艳蓓[14]研究了利用大豆皮酸法制备MCC素，余光等[15]研究了高温高压制备MCC新工艺，张丽君等[16]以大豆皮为原料，首次采用纤维素酶酶解法制备MCC。相比大豆皮中含有65%的膳食纤维，竹笋壳中膳食纤维的含量超过80%[17-18]。微晶纤维素纯度84.51%也优于之前张丽君制备的大豆皮MCC 30.12%。国外对MCC的研究较早，从1955年就已经初具生产规模，主要以稻壳、玉米芯、大小麦杆等制备微晶纤维素[19-21]。种类繁多，但基本路线一致。即采用酸水解，辅以一定的洗涤干燥步骤，微生物发酵即酶解还在发展过程中。本课题首次利用竹笋壳制备MCC，研究并优化其制备工艺，进行理化特性分析，为以后竹笋壳酶法制备MCC的研究提供了理论依据，并实现了竹笋壳的资源化利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

竹笋壳：贵州红赤水生态食品开发有限公司，烘干备用。

试剂：分析纯（重络酸钾，硫酸，过氧化氢，氢氧化钠，硫酸亚铁铵，邻菲罗啉）；纤维素酶：南宁庞博生物工程有限公司（酶活10000U/g）。

1.1.2 主要仪器设备

PHS-06型PH计；101型电热鼓风干燥箱；电冰箱；DK-98-IIA型电热恒温水浴锅；电子天平；CXC-06粗纤维测定仪。

1.2 方法

1.2.1 竹笋壳MCC的制备流程

竹笋壳原料→清洗烘干→粉碎过筛→稀酸混溶→碱煮（2.5h）→抽滤→漂白（H2O2）→抽滤→调pH（乙酸）→洗涤烘干→α-淀粉酶酶解→沸水灭酶→洗涤干燥→粉碎过筛→MCC

1.2.2 竹笋壳原料的预处理

将竹笋壳清洗两遍，然后放入55℃的鼓风干燥箱内烘干一天，待烘干完全，放入粉碎机粉碎，过60目筛，再进行烘干，然后放入密封袋中备用。

1.2.3 采用纤维素酶制备MCC

取烘干处理的竹笋壳粉末100g，置于1000mL稀硫酸溶液（1g/L）中混溶1h，以去除竹笋壳表面的毛及部分胶质。过滤三次，取滤渣，加入质量分数为8% NaOH溶液，迅速加热煮沸2.5h，待冷却后进行抽滤，分离固体滤渣并用蒸馏水冲洗。加3% 食品级H2O2漂白0.5h[22]，过滤并用蒸馏水冲洗三次，加100mL水，用稀醋酸调节pH至7.0，用蒸馏水洗涤除杂，抽滤。取滤渣于60℃电热鼓风干燥箱中烘干得竹笋壳α-纤维素[23]。

取以上制得的竹笋壳α-纤维素10g，放入锥形瓶中，然后加入水和纤维素酶，调节pH值，将锥形瓶放入恒温水浴锅中在一定温度及一定时间下水解，然后在沸水中灭酶6min ，调节pH值为7.0，抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤2次后于60℃干燥箱中干燥即得竹笋壳MCC[24]。

1.2.4 酶法制备竹笋壳MCC单因素实验

以上面五个因素做单因素实验，探究加酶量、酶解时间、酶解温度、液料比、酶解pH对竹笋MCC得率的影响。

1.2.5 酶法制備竹笋壳MCC正交实验

在液料比为1∶15（g/mL）的条件下，以加酶量（1.2%～1.8%）、酶解时间（50min～70min），酶解温度（47℃～53℃）、酶解pH值（5.0～6.0） 作为4因素，以MCC得率为指标，采用L9（34）正交设计，对酶法制备竹笋壳MCC的工艺进行优化，其因素水平设计见表2。

1.2.6 竹笋壳MCC得率测定[25]。

1.2.7 竹笋壳MCC理化性质测定

1.2.7.1 微晶纤维素溶胀性测定

精确称取烘干至恒重的竹笋壳MCC 3g，放于具塞刻度试管中，测定粉末的高度，加水10mL，充分震摇。静置24h，测定溶胀后MCC的高度，计算溶胀体积比，即溶胀后高度与溶胀前高度之比[26]。

1.2.7.2 MCC流动性测定

取半径为r的培养皿，放置于水平的无菌操作台，再取漏斗置于正上方，漏斗底部距离培养皿10cm，漏斗内加微晶纤维素自然流下，待覆盖培养皿底面即停，测量形成的高度（H）。按照tanα=Hr计算静止角α[27]。

1.2.7.3 MCC持水率的测定 准确称取5.00g烘干至恒重的样品，置于烧杯中，加入蒸馏水，浸泡20min，用滤纸包住挤压形成团，清水洗涤。再将样品放在干净玻璃板上，上面用另外一块玻璃板挤压，除去水分，直至样品粘在玻璃板上，取下，称重，即得湿润MCC质量[28]。

持水率=湿润MCC质量-干燥MCC质量湿润MCC质量×100%

1.3 数据分析

酶法制备竹笋壳MCC单因素实验采用Excel作图，并和正交试验均采用SPSS 17.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酶法制备竹笋壳MCC单因素实验结果与分析

2.1.1 加酶量对竹笋壳MCC的影响

纤维素完全降解分为五个过程，纤维素→MCC→纤维糊精→β系低聚糖→纤维二糖→D-葡萄糖[29]。从图1可以看出，纤维素酶的添加量可以影响MCC得率，当纤维素酶添加量小于1.5%时，MCC的得率随着纤维素酶的增加而增加。这可能是在MCC制备过程中添加一定量的纤维素酶，葡萄糖内切酶随机水解纤维素处于无定形区的分子链，使纤维素水解转化为MCC[30]。而当纤维素酶浓度继续增大，反而出现MCC得率下降。这是由于酶的添加量过大，使纤维素和MCC进一步水解成纤维糊精，并进一步转化为纤维二糖以及葡萄糖[31]。故选择加酶量1.2%～1.8%设计正交试验。

2.1.2 酶解时间对竹笋壳MCC的影响

从图2可以看出，1 h以后，随着酶解时间的增加，MCC得率逐渐缓慢降低。这是由于在纤维素酶作用1h后，已经把其中的一部分纤维素水解成糖类。而在此之前，纤维素并没有水解完全[32]。故选取50min～70min设计正交实验因素水平。

2.1.3 酶解温度对竹笋壳MCC的影响

从图3可以看出，当酶解温度小于50℃的时候，随着温度的上升，竹笋壳MCC得率上升，而高于50℃以后有一个下降的趋势。说明纤维素酶对于竹笋壳为底物的时候，最佳的水解温度为50℃左右[33]。故选取47℃～53℃设计正交实验因素水平。

2.1.5 酶解pH值对竹笋壳MCC的影响

从图5可以看出，当pH为5.5时，MCC得率最高，这跟纤维素酶的活性有关，酸性环境和碱性环境都会抑制纤维素酶的活性[35]。故选取pH5～6设计正交实验因素水平。

2.2 酶法制备竹笋壳MCC正交实验结果与分析

从表4可以看出，各因素作用的主次顺序是加酶量（A）> pH（D）> 酶解温度（C）> 酶解时间（B）。制备MCC的最优工艺条件为A1B1C3D1。在此条件下用竹笋壳纤维素制备MCC，重复试验3次，平均含量为84.51%，高于所有正交试验实验组的MCC的含量。因此确定竹笋壳MCC的最佳制备工艺为加酶量1.2%，酶解时间50 min，酶解温度53℃，溶液pH为5。

从表5可以看出，对正交试验的结果进行方差分析，可以看出加酶量与pH差异极显著，在竹笋壳MCC的制备过程中起到最关键的作用，酶解温度差异显著，在制备过程中有很重要的影响，酶解时间对实验结果的影响较小，这与正交试验直观分析是相符的。

2.3 竹笋壳MCC与“新望”MCC的扫描电镜分析

竹笋壳MCC与湖州市菱湖化学有限公司商品MCC放大100倍的扫描电镜扫描图[36]如图6、7所示，从扫描图中可以看出，竹笋壳MCC大多呈短棒状态，分子之间的孔洞较大，表面出现凹坑，结构较为疏松，比表面积相对较大；“新望”MCC大多呈长棒状态，分子之间的孔洞较小，表面只有一些沟痕，结构较为紧密，裂纹比较均匀。

2.4 竹笋壳MCC的理化特性分析及与“新望”MCC比较

湖州市菱湖化学有限公司商品MCC在食品工业上作为重要的功能性食品膳食纤维，是一种理想的保健品食品添加剂，可以直接进行干粉压片，用于作为保健品食品的赋形剂、抗黏剂、填充剂、吸附剂、胶囊稀释剂、流动性助剂等。在此通过竹笋壳MCC的理化特性与之进行比较，结果如表6。

从外观上来看，“新望”MCC为白色细小粉末，不溶于水、稀酸、稀碱溶液和大多数有机溶剂。而竹笋壳MCC为微黄细小粉末，颗粒大于商品MCC，流动性小于商品MCC，物理特性与“新望”MCC区别不显著，商品MCC卖相更好。结合扫描电镜形态分析，竹笋壳微晶纤维素表面更为疏松，孔洞较大，更好地解释了在溶胀体积比方面，竹笋壳MCC高于商品MCC，而在持水率方面，竹笋壳MCC持水性更好的原因。故竹笋壳MCC更容易形成饱腹感，有利减肥；加大人体排便的体积和速度，从而可有效的防止便秘所引起的结肠癌[37]；在加强肠道蠕动，吸附肠内毒素方面更有利于人体健康。扫描电镜分析结果与理化特性结果吻合。

3 结论与讨论

经过洗涤、烘干、粉碎、过筛、稀酸混溶、碱煮、洗涤除杂、烘干一系列方法制取竹笋壳α-纤维素，再采用纤维素酶酶法制备竹笋壳MCC。并通过单因素和正交试验探索竹笋壳制备MCC素的工艺。确定竹笋壳MCC的最佳工艺条件为：液料比为1∶15（g/mL），加酶量1.2%，酶解时间50 min，酶解温度53℃，溶液pH为5。竹笋壳MCC的理化特性都与“新望”商品MCC相近，初步达到了商品MCC的要求。相比酸法制备MCC，本方法无废气，废渣排放，母液可以循环利用，生产废水经处理可达到排放要求。对竹笋壳MCC采用扫描电镜进行扫描，竹笋壳MCC分子间孔洞较大，结构疏松，比表面积较大，从微观上解释了竹笋壳MCC吸水后溶胀体积更大，持水力更强的原因。竹笋壳MCC在肠道中会产生更大的容积，更有利于加强肠道蠕动，防止便秘，在吸附肠内毒素方面也有更好的效果，有利于人体健康。

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