金银花、山银花药效与安全性研究

李文沛 俸婷婷 周英

摘 要：研究金银花、山银花提取物的体外抑菌、体内解热和抗内毒素作用以及对用药安全性进行探讨。采用微量肉汤法测定提取物对供试菌株的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；通过建立大鼠内毒素LPS热毒血症模型测定大鼠下丘脑cAMP、AVP和血液中ET含量变化研究提取物解热和抗内毒素能力；通过建立大鼠致敏模型测定血液中IgE比较用药安全性。结果表明提取物对除白色念珠菌外的供试菌株具有较好的抑制作用，有很好的体内解热和抗内毒素作用，安全性结果表明高剂量的灰毡毛忍冬提取物会导致大鼠过敏。证实金银花、山银花具有较好的抑菌活性、解热和抗内毒素作用，高剂量用药存在过敏风险。

关键词：金银花；抑菌作用；cAMP；ET；IgE

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）03-00 -0 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.001

Study on the pharmacodynamics and safety of Flos Lonicerae Japonicae and Flos Lonicerae

LI wen-pei1，2，3，FENG Ting-ting2，3，ZHOU Ying2，3*

（1.College of Pharmacy， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China； 2. Guizhou Traditional Chinese Medicine and Ethnic Drug Engineering Center， Guiyang， Guizhou 550025， China； 3. Guizhou Medicine Edible Plant Resources Research and Development Center， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：The bacteriostatic， antipyretic and antiendotoxin effect of extracts from Flos lonicerae japonicae and Flos lonicerae was studied and the safety of using them as medicine discussed. The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of the extracts against tested microbes were determined by microbroth method. The content changes of hypothalamic cAMP and AVP and ET in blood were determined by establishing a rat model of endotoxin LPS hyperthermia in order to study the antipyretic and anti-endotoxin ability of the extract. The safety of IgE in blood was determined through a rat allergic model. The results showed that the extract of Flos lonicerae japonica and Flos lonicerae has good antipyretic and anti-endotoxin effect and better inhibitory effect on the tested microbes except Candida albicans. Safety results showed that high dose of the extract could lead to anaphylaxis.

Key words： Flos Lonicerae japonica； antibacterial； cAMP；antipyretic； anti-endotoxin.

金銀花（Flos lonicerae japonica ）与山银花（Flos lonicerae）是忍冬科忍冬属植物干燥的花蕾或带初开的花，其中忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）被列为金银花唯一的药源植物，其余收录在山银花中。两者都具有清热解毒，疏散风热之功效，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症[1]。近年来研究表明金银花具有广谱抗菌、抗病毒、增强免疫力，抗氧化，解热抗炎、保肝、降血糖、抗肿瘤[2-5]等多种药理作用。研究表明在致热源可导致体温调节中枢的调定点上移引起发热，cAMP是调节体温的重要的中枢制热介质，与体温呈正相关[6]，精氨酸加压素（AVP）是由下丘脑合成的九肽神经肽，与体温升高呈负反馈调节，测定下丘脑中的cAMP、AVP含量变化能在一定程度上反映药物对体温调节中枢的作用[7]。免疫球蛋白E（IgE）是临床判断超敏反应的重要指标[8]，为探讨金银花、山银花用药的安全性，拟建立动物制敏模型，与模型组比较评价其安全性。本实验以忍冬、黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）、灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides）[9]的水提物与70%乙醇提物为研究对象，分别观察其体外对常见病原菌的抑制作用，进行体内解热、抗内毒素及安全性实验，为研制中药制剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003；白色念珠菌CMCC（B）98001；变形杆菌CMCC（B）49027；枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501；大肠杆菌CMCC（B）44289；铜绿假单胞菌CMCC（B）10104（中国医学微生物菌种保藏中心）；粪肠球菌ATCC 29212（美国标准菌库）。

1.2 供试药材

黄褐毛忍冬：安农德卧（安龙县德卧镇大水沟村提供）

忍冬：巨花一号（安顺市镇宁县黄果树采摘）

灰毡毛忍冬：绥阳灰毡（绥阳县茅娅镇拥德村龙二组提供）。

1.3 药物与试剂

营养琼脂（上海博微生物技术有限责任公司 批号：170405），营养肉汤（杭州百思生物技术有限责任公司 批号：20170701001），青霉素钠（北京哈药责任有限公司，批号：080091248），NEST96孔板（海门市春博生物实验器材厂，批号：071017A005），胎牛血清50 mL（浙江天航生物科技股份有限公司，批号：11011-8611），内毒素LPS（合肥博美生物有限公司，Sigma L2880），大鼠环磷酸腺苷（cAMP）、精氨酸加压素（AVP）、内毒素（ET）、免疫球蛋白E（IgE）ELISA检测试剂盒（安徽莱尔科技有限公司），一次性负压采血管（山东省成武县医疗制品厂，批号：20170402）。

1.4 实验仪器

立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号YQX-LS-50SⅡ）、恒温恒湿培养箱（北京科伟永兴仪器有限公司，型号：HWS-150）、冰箱（青岛海尔股份有限公司，型号：GB 12021.2-2008）、电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：WGL-685）、超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：CJ-2D）、恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司，型号：ZWYR-2012C）。

1.5 实验动物

清潔级SD大鼠，体重230～260 g。（购于成都动物培养所）。

1.6 体外抑菌试验方法

1.6.1 金银花、山银花水提物、70%乙醇提取物的制备

水提取物的制备 称取不同品种的干燥药材50 g，以料液比1∶8加入蒸馏水，煮沸回流提取90 min收集滤液，同法将药渣煮沸回流提取2次。合并滤液，减压浓缩成浸膏后冷冻干燥，称取冷冻干燥的提取物加蒸馏水配置成2.048 g/mL的待测药液即为水提取物。同法制备70%乙醇提取物，动物实验提取物料液比为1∶20。

1.6.2 实验菌悬液的制备

配置营养肉汤培养基并分装于150 mL三角瓶，置于灭菌锅高温高压灭菌20 min冷却待用。在无菌操作台内用灼烧后的接种环挑取冻干菌粉末置于预先冷却待用的无菌液体培养基内，摇晃均匀放置在37℃的100 r/min的摇床培养24 h。取1 mL菌液稀释1×106、1×107、1×108均匀涂布在无菌琼脂平板培养18 h进行菌落计数，计算合适稀释倍数使菌落数约为2×106CFU/mL。

1.6.3 最低抑菌浓度（MIC）与最低杀菌浓度（MBC）的测定

根据CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度MIC，在超净工作台内取一次性无菌96孔板，设置实验组A1～A9；阳性组A10；正常组A11；空白组A12。除第一列外，向A1～A9孔各加入100 μl营养肉汤，向第一列A1～A9加入200 μl待测药液，从第一列孔吸取100 μl药液加入第二列混匀吸取100 μl加入第三列直至第八列依次倍半稀释，从第八列吸取100 μl弃去。再吸取100 μl配置好的菌悬液加入各孔中混匀，使A1～A9药液浓度为1024、512、256、128、64、32、16、8、4 mg/mL，菌浓度为1×106 CFU/mL。A10孔中加入2万单位的青霉素钠100 μl和100 μl营养肉汤，A11孔加入100 μl营养肉汤和100 μl的菌悬液，A12孔加入200 μl的营养肉汤，使每孔均为200 μl。将96孔板放置在37℃恒温培养箱培养18 h后取出，观察读取MIC，以与澄清透光组对应的最低浓度孔为MIC。从上述各孔中吸取100 μl加到预先配置好的无菌营养琼脂平板内，各浓度设置4个平行板，用灼烧冷却后的涂布棒均匀涂板，然后放置在恒温培养箱内培养18 h，取出观察，以肉眼观察没有菌落或者菌落数少于5个的孔对应的最低药液浓度作为MBC。

1.7 解热与抗内毒素试验方法

1.7.1 LPS热毒血症模型建立

根据《中国药典》2015年版金银花、山银花的人的临床剂量，计算实验大鼠临床剂量约为1.35 g/kg（生药量），设置低、中、高剂量药物浓度梯度，低剂量组为5倍临床剂量6.75 g/kg，中剂量组为10倍临床剂量13.5 g/kg，高剂量组为20倍浓度临床剂量27 g/kg。取168只SD大鼠分为21组，每组8只雌雄各半。第一至九组分别为三种药材水提物高中低剂量，第十至十八组分别为三种药材70%乙醇提物高中低剂量，十九组为LPS模型组，二十组为板蓝根组给予6.75 g/kg（生药量）板蓝根冲剂，二十一组为正常组给予生理盐水灌胃。前二十组每天灌胃给药1次，连续给药6天，第6天给药之后禁食不禁水过夜，第7天给药后1小时各组腹腔注射LPS内毒素100 μg/kg造模。

1.7.2 大鼠下丘脑cAMP、AVP含量测定

发热高峰6 h将大鼠断头法处死，于冰浴下迅速取出全脑，于视交叉与灰结节之间取下丘脑组织。称取 50 mg 新鲜下丘脑组织，加入细胞裂解液0.5 mL，室温裂解30 min。超声裂解1 min后4℃、13000 r/min离心15 min，取上清液采用双抗体夹心ELISA 法测定cAMP、AVP含量，按试剂盒说明操作进行测定。

1.7.3 大鼠血清内毒素ET含量测定

发热高峰6 h用乙醚将大鼠麻醉，采用腹腔主动脉取血法，用一次性负压肝素钠管取血5 mL，3000 r/min离心0.5 h，取上清。采用双抗体夹心ELISA 法测定血液ET含量，测定方法按试剂盒说明操作。

1.8 安全性实验方法

1.8.1 大鼠过敏模型建立

参照国家食品药品监督管理局《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》设置金银花与山银花水提物低、高药物浓度梯度，低浓度为临床剂量5倍（6.75 g/kg），高剂量为临床剂量10倍（13.5 g/kg）。取64只SD大鼠，分为8组，每组6只雌雄各半。第一至六组分别为三种药材提取物低、高浓度，第七组为过敏模型，第八组为正常对照组。第一至六组每天灌胃给药一次连续给药10天，第七组采用大鼠尾静脉推注10 mg/mL的胎牛血清1 mL，隔日给药方式。第八组尾静脉推注生理盐水1 mL。

1.8.2 大鼠免疫球蛋白IgE测定

末次给药10 h后用乙醚将大鼠麻醉，采用腹腔主动脉取血法，用一次性负压肝素钠管取血5 mL以上，3000 r/min离心0.5 h，取上清。采用双抗体夹心ELISA 法测定血液IgE含量，测定方法按试剂盒说明操作。

1.9 统计学方法

数据均以平均值±标准差（x±s）表示。采用STATVIEW 统计软件进行ANOVA 和 t-tests分析，当P<0.05时认为结果具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 金银花、山银花提取物抑菌结果

供试的三种中药材在实验设计浓度下的体外抑菌结果见表1、表2。

结果显示：水提物的抑菌作用要明显优于70%乙醇提取物抑菌作用。金银花、山银花的抑菌作用有明显差异，供试药材抑菌强弱顺序：巨花一号>安农德卧>绥阳灰毡。金银花、山银花提取物对白色念珠菌均无抑制作用，对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较好的抑菌作用。

2.2 金银花、山银花解热作用结果

表3结果显示：与模型组比较正常组（P<0.01）说明造模成功。与模型组比较各组具有显著性差异（P<0.05）说明提取物均有抑制下丘脑cAMP升高的作用，其中绥阳灰毡低、中、高剂量组与模型组比较表现出极显著差异（P<0.01）。

表4结果显示：与模型组比较正常组（P<0.01）说明造模成功。与模型组比较各组标出极显著性差异（P<0.01），从下丘脑AVP含量上看实验各组均大于模型组，说明提取物均有促进抗利尿激素AVP升高的作用，其中70%乙醇绥阳灰毡毛忍冬高剂量组对促进抗利尿激素升高效果最好。

2.3 金银花、山银花抗内毒素作用结果

表5结果显示：与模型组比较正常组（P<0.01）说明造模成功。与模型组比较各组表现出极显著性差异（P<0.01），说明各组都有明显的抗内毒素作用。其中巨花一号水提物与醇提物对ET清除作用相当，安农德卧和绥阳灰毡70%乙醇提取对ET的清除要效果优于水提物的清除效果，其中绥阳灰毡醇提物高剂量组对内毒素ET的清除效果最佳。

2.4 金银花、山银花体内过敏实验结果

表6结果显示：与过敏模型组比较正常组（P<0.01）说明造模成功，除绥阳灰毡高剂量组外与模型组（P<0.01）表现出极显著差异，与正常组比较巨花一号高剂量与绥阳灰毡高剂量组（P<0.01）表现出极显著差异，血清IgE含量比较，巨花一号高剂量组血清IgE含量小于正常组表明未引起过敏反应，绥阳灰毡高剂量组血清IgE含量明显高于正常对照组，交叉对比说明绥阳灰毡高剂组引起机体过敏反应。

3 结论与讨论

文献中记录金银花和山银花在体外抑菌活性上存在差异，经阅读文献比较发现体外抑菌实验影响因素较多，其中主要影响因素为药材产地、试验方法、提取工艺、供试菌浓度、中药材提取部位等[10]，本实验中金银花、山银花均取自贵州本地，可为本地相关研究提供参考。本研究表明金银花、山银花解热作用和抗内毒素作用存在明显差异，其中忍冬和灰毡毛忍冬的解热效果优于黄褐毛忍冬，灰毡毛忍冬抗内毒素作用优于忍冬，推测由于金银花与山银花在化学成分含量方面存在差异，灰毡毛忍冬中绿原酸类化合物含量明显高于金银花[11]，绿原酸有较高清除自由基作用，而金银花较山银花含有较多木犀草苷[12-13]，木犀草苷能显著提高自由基，金银花与山银花的药效是绿原酸、挥发油、黄酮类、三萜皂甙等多种成分共同作用的结果。过敏实验结果显示高剂量的灰毡毛忍冬提取物会引起小鼠超敏反应，高剂量的忍冬提取物并未引起过敏，在精细医疗中不可选择有潜在用药风险的山银花，另外木犀草苷中某些成份浓度过高会对正常细胞（如人体肺胚胎纤维原细胞、人体脐带血管内皮细胞）有毒副性作用[14]，因此用药剂量及不同中药材混用需要更多探讨；此外中国是滥用抗生素最严重的国家之一，不合理的使用抗生素会对人体带来巨大负担同时产生更多耐药菌种，开发中药抗生素替代品具有巨大的应用前景[15]，本文旨为金银花、山银花的临床开发与应用提供参考。

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