玉屏风散对支气管哮喘小鼠白细胞介素-10和血管细胞黏附分子-1表达的影响

何炜，冷蓓峥，揭志军

(复旦大学附属上海市第五人民医院，上海　200240)

支气管哮喘是以气道慢性炎症和气道高反应性为主要特征的一种慢性炎症性疾病。影响了世界上约3亿人群，并且其发病率和严重性正在日益增大。

临床观察发现，玉屏风散对呼吸道疾病有较好的治疗作用和预防作用[1]。玉屏风散是一种Th1免疫反应刺激剂，但玉屏风散对免疫调节治疗哮喘的机制尚不明确。IL-10是炎症抑制因子，对IL-4、IL-12等多种炎症因子具有抑制作用。大量的IL-10可抑制Th2细胞，从而抑制哮喘和过敏性疾病。VCAM-1主要在血管内皮和上皮细胞表达，能特异性介导嗜酸粒细胞浸润到肺组织，受IL-4等多种因子的调节，在促进哮喘的发生和发展中起了重要作用[2]。本研究通过观察支气管哮喘模型小鼠肺组织IL-10、VACM-1的mRNA和蛋白表达，探讨玉屏风散对哮喘的干预作用。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1动物

健康8周龄雌性Balb/c小鼠40只，体质量(23.52±1.27)g，由复旦大学试验动物部提供(合格证：2009001901569)。饲养在CL级动物实验室(上海市动物管理学会合格证：20090082)，普通饲料喂养。

1.1.2主要试剂和药物

卵白蛋白(Sigma公司)；IL-10 ELISA检测试剂(Bender Medsystems公司)； Trizol(Invitrogen公司，编号15596-026)；逆转录试剂盒(Thermo公司，#K1622)；PCR试剂(Thermo公司，F-415XL)。

玉屏风散水煎剂：按文献方法运用微波技术提取水煎剂，含玉屏风散生药96.38 mg/ml。

1.2　小鼠模型建立与分组

采用腹腔注射致敏，雾化吸入激发造模。Balb/c小鼠致敏方法参照文献报道[3]。根据随机数字表，将40只小鼠随机分为4组，每组10只。

1.2.1模型组(OVA 组)

第1天给予小鼠腹腔注射0.2 ml致敏液(含OVA 100 μg，氢氧化铝1 mg)，第14天后重复致敏一次，激发于第24～30天,将小鼠置于密闭容器(20 cm×40 cm×50 cm)中 ，以1%的OVA溶液10 ml雾化吸入，每天1次，每次30 min。在最后1次激发后48 h内 (第32天)处死小鼠。

1.2.2玉屏风组

第1天给予小鼠腹腔注射0.2 ml致敏液，第14天后重复致敏一次，激发于第24～30天,将小鼠置于密闭容器，OVA溶液10 ml雾化吸入，每天1次，每次30 min。第24～30天,玉屏风灌胃治疗，在最后1次激发后48 h (第32天)处死小鼠。

1.2.3布地奈德组

第1天给予小鼠腹腔注射0.2 ml致敏液，第14天后重复致敏一次，激发于第24～30天,将小鼠置于密闭容器，OVA溶液10 ml雾化吸入，在雾化吸入OVA前30 min雾化吸入布地奈德混悬液8 ml，每天1次，每次30 min。在最后1次激发后48 h(第32天)处死小鼠。

1.2.4对照组

第1天给予小鼠腹腔注射0.2 ml生理盐水，第14天后重复注射一次，激发于第24～30天,将小鼠置于密闭容器，以1%生理盐水溶液超声雾化激发，每天1次，每次30 min。第24～30天同时给予纯水10 ml/kg灌胃，每天1次，在最后1次激发后48 h(第32天)处死小鼠。

1.3　标本收集

末次激发24 h后，将4组小鼠进行眼球摘除采血。

支气管肺泡灌洗液(BALF)：小鼠颈前暴露气管，插入气管插管针，结扎右肺门根部，左肺行支气管肺泡灌洗，收集上清液储存于-20℃冰箱待测细胞因子。

组织总RNA的抽提：结扎右肺门根部，采用高温灭酶的剪刀和镊子取右肺组织置于冻存管，液氮速冻，保存在-80℃冰箱，备RNA抽提。依次将各组组织100 mg转移至5 ml玻璃试管中，每一管中加入1 ml预冷Trizol；匀浆，每个样本匀浆后用75%的酒精棉球擦拭匀浆器， DEPC处理水清洗。转移到无RNA酶的离心管中。室温放置5 min，加入氯仿，振荡，离心15 min。吸出上层水相约500 μl 转移至无RNA酶的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀6～8次，-20℃冰箱放置30 min。离心15 min，可见RNA沉淀；弃上清，75%乙醇洗涤沉淀，离心5 min，弃上清。重复步骤一遍，弃上清，吸净残存乙醇，自然干燥；20 μl DEPC处理水，溶解RNA，-80℃冰箱，待用。

逆转录cDNA：将试剂盒从-80℃冰箱取出，复融，将5×逆转录buffer，dNTPs，MMLV，oligo(dT)10 000 r/min，数秒。将经过稀释后的RNA样本进行实时定量荧光PCR。

1.4　检测项目

双抗体夹心ELISA法检测IL-10；实时荧光定量法(RT-PCR)检测肺组织IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的表达。

引物由上海基尔顿公司设计。引物序列如下：VCAM-1：上游5′GATAGACAGCCCACTAAACG 3′，下游5′TGGAGCCAAACACTTGAC 3′。IL-10： 5′CCTGTGTTTAAGCTGTTTC 3′，下游5′AAGACCCATGAGTTTCTTC 3′。GAPDH：上游5′ATCACTGCCACCCAGAAG 3′，下游5′TCCACGACGGACACATTG 3′。PCR反应条件：95℃10 min预变性后进入循环，95℃变性15 s，退火温度退火45 s ，反应40个循环，60℃延伸7 min。

ELISA法检测BALF中IL-10蛋白表达的水平，测定结果按照标准曲线换算。

1.5　统计学处理

2　结果

2.1　实时荧光定量法检测肺组织IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA的表达比较

以GAPDH为内参照计算其相对比值。One-Way ANOVA统计，模型组，玉屏风组，布地奈德组IL-10 mRNA的表达与对照组相比明显增加，有显著性差异(F=3.78，P<0.05)。玉屏风组，布地奈德组VCAM-1 mRNA的表达与模型组相比明显降低，有显著性差异(F=4.84，P<0.05)。结果见表1。

表1　各组小鼠肺组织IL-10 mRNA和VCAM-1 mRNA水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2　ELISA法检测BALF IL-10的水平比较

采用One-WayANOVA统计，BALF中IL-10的水平，玉屏风组、布地奈德组与模型组相比明显升高，有统计学差异(F=7.26，P<0.05)，模型组和对照组相比降低，且有统计学差异(P<0.05)，玉屏风组和布地奈德组无统计学差异(P>0.05)。结果见表2。

表2　ELISA法检测BALF中IL-10(pg/ml)的水平比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与对照组比较，￥P<0.05；与布地奈德组比较，#P>0.05

3　讨论

哮喘是气道的慢性非特异性炎症反应，其中部分气道是以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润，导致气道对外界刺激物高反应性,甚至引发支气管痉挛。在哮喘气道炎症中，辅助性T细胞(Th细胞)产生细胞因子，可分为Thl和Th2两种亚型细胞。Thl细胞分泌白介素-2、白介素-12和淋巴毒素等，主要介导细胞免疫应答，杀灭细胞内病原体等。Th2细胞分泌IL-4、IL-5等，主要介导体液免疫应答，抑制单核-巨噬细胞的激活等，导致疾病发生和加剧。研究表明，Th2细胞占优势的Thl/Th2失平衡是哮喘发病的一个重要原因。

玉屏风散是一种Th1免疫反应刺激剂，而玉屏风散对免疫调节治疗哮喘的机制尚不明确。小鼠白介素-10是炎症抑制因子，对IL-4、IL-12等多种炎症因子具有抑制作用。大量的IL-10可抑制Th2细胞，从而抑制哮喘和过敏性疾病。

本次试验中，模型组，玉屏风组，布地奈德组IL-10 mRNA的表达与对照组相比明显增加，有显著性差异。

关于IL-10在哮喘中的异常表达尚无定论。Simon等发现[4]，重度哮喘患者BALF中IL-10高于哮喘稳定期和正常对照组。但更多研究显示，哮喘发作时IL-10水平降低[5]。过敏性和非过敏性哮喘患儿与正常对照组比较,外周血T 细胞表达IL-10 mRNA都降低[6]。本实验中哮喘组小鼠治疗后，IL-10水平普遍升高。可能是特异性免疫治疗后，抗原特异性T 细胞分泌IL-10和转化生长因子TGF-β明显增加[7]，抑制T细胞增殖反应和IL-4、IL-5、IL-13 分泌，降低对突变原反应性。IL-10在治疗后上升，增强特异性T细胞免疫耐受和免疫抑制。因此IL-10水平可能提示哮喘治疗的敏感性和预后。

在复杂的调控系统中，IL-10是一个极其重要的细胞因子，具有抗炎症作用，能缓解过敏的气道炎症[8]。本实验在小鼠激发的同时给予玉屏风散灌胃，结果显示玉屏风组，布地奈德组IL-10 mRNA的表达与对照组相比有明显增加，差异有显著性。BALF中IL-10的含量，也是升高的。说明致敏的小鼠用一定剂量的玉屏风散，可以升高IL-10的水平，调节机体的免疫，对支气管哮喘气道炎症，有一定的缓解作用。

哮喘患者肺组织中的嗜酸性粒细胞炎症是呼吸道变应性炎症的一个重要特征。VCAM-1作为一种特异性介导嗜酸粒细胞浸润到支气管黏膜，甚至到肺组织的黏附分子，在哮喘中可能扮演了另一个重要的角色。本次试验中，玉屏风组，布地奈德组VCAM-1 mRNA的表达与模型组比较明显降低，有显著性差异。

有报道称[9-10]，可溶性黏附分子，可以预示炎症存在，血液中可溶性黏附分子主要来源于细胞膜黏附分子的脱落，另一部分来自受损细胞的细胞黏附分子的分泌。在对支气管哮喘急性发作患儿研究中发现，VCAM-1显著升高，但在疾病缓解期降低。在过敏原刺激后18 h的哮喘患者BALF液中，VCAM-1水平增高。与支气管哮喘缓解期患者相比，哮喘急性发作期时，外周血中VCAM-1水平呈显著性增加。处于支气管哮喘急性期患者，其血液和BALF中可溶性黏附分子浓度升高[11-12]，反映了这个阶段呼吸道广泛性的炎症反应。本次实验，激发的模型组小鼠VCAM-1 mRNA表达较对照组明显升高。在小鼠激发的同时给予玉屏风散灌胃，结果显示玉屏风组，布地奈德组VCAM-1 mRNA的表达与模型组相比明显降低，差异有显著性。说明细胞黏附分子在支气管哮喘的炎症形成和气道高反应性中起了重要的作用[13-14]。玉屏风组降低VCAM-1水平，参加机体的免疫调节，缓解哮喘发作[10]。

糖皮质激素作为经典药物目前仍是哮喘主要治疗手段[15]，但长期应用存在大量的副作用。本次实验中，玉屏风组和布地奈德组在IL-10 mRNA，VCAM-1 mRNA表达上无统计学差异，可见哮喘治疗后，IL-10 水平普遍升高，不论应用玉屏风散灌胃或雾化吸入布地奈德，均可显著提升炎症抑制因子的表达。IL-10能明显拮抗过敏性炎症。本次实验中卵蛋白激发小鼠的时间短，样本量不多，虽不能与临床实际完全符合，但玉屏风散相对于糖皮质激素而言，副作用小，临床安全性高，为临床治疗哮喘提供了一个新的思路。