芦荟多糖对免疫功能影响的实验研究

朱鸿哲

(哈尔滨体育学院，黑龙江　哈尔滨　150001)

芦荟[Aloeveravar.chinesis(haw.)Berg.]为百合科植物芦荟或同属植物的叶汁干燥品，含有蒽醌类化合物、糖类、氨基酸和各种有机酸、活性酶等多种化学成分[1]。《本草汇言》中就有“芦荟，凉肝杀虫之药也，凡属肝脏为病，有热者，用之必无疑也。但味极苦，气极寒，诸苦寒无出其右者”的记载[2]。现代研究表明，已知芦荟含有160多种化学成分，其中有生物活性或药理作用的成分不少于100种，但就其特殊性和功效而言，主要包括蒽醌类化合物和芦荟多糖两大类。其中芦荟多糖因其具有调节免疫、防辐射、抗肿瘤[3]等现代药理作用而受到广泛关注。

中医学自《黄帝内经》起就把“治未病”作为主导思想，而“治未病”的重心就在于增强机体的免疫力、提高机体的抗病能力[4-6]。芦荟作为一种传统且易得的药用植物，如能将其增强免疫的机理与传统中医药理论相结合，无疑将带来巨大的现实意义。近年来，有大量的研究报道涉及芦荟多糖的增强免疫功能，但对其作用机理的研究并不透彻，本实验着重研究芦荟多糖在单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性两个方面的作用，以期阐明其增强免疫作用的机理。

1　材料和方法

1.1　样品

芦荟多糖：自制。取库拉索芦荟，原料清洗→去皮称重→打浆→按比例加水→加热浸提(超声波处理30 min)→抽滤→清液保留，残渣再提取，合并提取液→浓缩→除蛋白→加95%乙醇沉淀→复溶后再加95%乙醇沉淀，反复3次→无水乙醇洗涤沉淀多糖→低温真空干燥→芦荟粗多糖[7]。

1.2　动物

80只清洁级、雄性、体质量18～22 g的KM小鼠，哈尔滨医科大学试验动物学部提供，许可证号：SCXK(黑)2013-001；饲料由哈尔滨医科大学试验动物学部提供，许可证号：SCXK(黑)2013-001；饲养环境为清洁级环境，温度(23±2)℃，湿度(55±10)%。

1.3　分组及给药

取120只小鼠，按体质量随机分成3个免疫实验组，每个免疫实验组设3个剂量组：260 mg/kg·BW(高剂量组，相当于成人推荐剂量的20倍)、195 mg/kg·BW(中剂量组，相当于成人推荐剂量的15倍)、130 mg/kg·BW(低剂量组，相当于成人推荐剂量的10倍)，同时设立一个阴性对照组。第一免疫实验组进行碳廓清试验，第二免疫实验组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验，第三免疫实验组进行NK细胞活性测定试验。

各剂量组配制方法如下：高剂量组取样品2 g加蒸馏水研磨至154 mL、中剂量组取样品1.6 g加蒸馏水研磨至164 mL，低剂量组取样品1 g加蒸馏水研磨至154 mL。各组动物均按20 mL/kg·BW分别经口灌胃，给予不同浓度的受试物，阴性对照组给予等容积蒸馏水作为对照。连续灌胃30天后，进行相关免疫学实验。

1.4　主要仪器与试剂

动物天平(德国Sartorius公司，BSA2201型)；紫外可见分光光度计(北京普析公司，TU-1901型)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司，3111型)；酶标仪(瑞士Tecan公司，Sunrise型)；电子天平(瑞士METTLER公司，AL204型)；离心机(德国SIGMA公司，6-16K型)；显微镜(日本OLYMPUS公司，BX53型)；智能循环水浴(德国IKA公司，IC control pro 20 c型)；恒温恒湿培养箱(美国Thermo Fisher公司，Forma3913)；无菌解剖器械、细胞计数板、纱布、载玻片、玻璃平皿、离心管、培养板。

RPMI 1640培养液(GIBCO公司，批号8113016)；胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司，批号121017)；青-链霉素(吉诺生物医药技术有限公司，批号11102101)；Giemsa染液(Sigma公司，批号BCBF9150)；氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司，批号110723A9)。

1.5　试验方法

1.5.1小鼠碳粒廓清试验[8-9]

小鼠经尾静脉注射墨汁，按每10 g体质量0.1 mL计算，在墨汁注射后2 min及10 min时，分别从小鼠眼眶静脉丛采血20 μL，即刻加入到2 mL的0.1%浓度Na2CO3溶液中，同时以0.1%浓度的Na2CO3溶液调零，用紫外可见分光光度计(波长600 nm)测OD值。将小鼠处死取脾脏及肝脏，称重并计算各组小鼠的吞噬指数α。

1.5.2半体内法测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验[8-10]

制备鸡红细胞(CRBC)悬液：将鸡血放置在有玻璃珠的锥形瓶中脱纤，将锥形瓶以单一方向晃动，加0.9%氯化钠注射液反复洗涤2次，离心10 min去上清液(2 000 r/min)后以0.9%氯化钠注射液将其配制成20%的CRBC悬液。

每只小鼠腹腔注射以上述方法制备的20%的CRBC悬液1 mL，30 min后脱臼处死小鼠，将其仰卧位固定，沿腹壁正中线剖开皮肤，经腹腔注射0.9%氯化钠注射液，轻轻晃动固定板1 min后吸出腹腔洗液1 mL，各取0.5 mL分别滴于2个载玻片上，置于湿盒移置37℃恒温培养箱孵育30 min。取出后用0.9%氯化钠注射液漂洗以除悬浮细胞，晾干，以丙酮甲醇溶液(1∶1)固定后，用4%吉姆萨磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干。计算吞噬指数以及吞噬百分率。

1.5.3NK细胞活性测定[8-9]

处死小鼠，取其脾脏剪碎，过200目筛，用Hank's液反复将其洗涤3次，用培养液调整细胞悬液浓度，使其终浓度调整为2×107个/mL。选用U型底96孔板，每只小鼠细胞悬液平行做3孔，均各取100 μL；靶细胞自然释放孔(3孔)加培养液及靶细胞体积各100 μL；靶细胞最大释放孔(3孔)加1% NP40及靶细胞体积各100 μL。于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养4 h后取出，离心5 min(1 500 r/min)，从每孔中吸取上清液100 μL，将其置于平底96孔板中，同时在每孔中分别加入基质液100 μL。计时3 min后每孔加入浓度为1 moL/L的盐酸溶液30 μL以终止反应, 在酶标仪波长为490 nm处测定各反应孔吸光度, 并计算NK细胞活性。

1.6　统计学处理

2　结果

2.1　小鼠碳粒廓清试验

由表1可知，经口灌胃给予不同剂量的芦荟多糖30天后，与阴性对照组比较，各组小鼠碳粒廓清吞噬指数具有不同程度的增加，其中高剂量组与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。即芦荟多糖具有增强小鼠碳粒廓清的功能。

表1　芦荟多糖对小鼠碳粒廓清试验的影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05

2.2　小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)

由表2可知，经口给予小鼠不同剂量芦荟多糖30天后，各剂量组吞噬百分率、吞噬指数与阴性对照组比较，均有不同程度的增加，其中高剂量组与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明芦荟多糖有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的功能。

表2　芦荟多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)的影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05

2.3　NK细胞活性测定

由表3可知，经口给予小鼠不同剂量芦荟多糖30天后，小鼠NK细胞活性试验高、中剂量组NK细胞活性与阴性对照组比较，均有显著性差异(P<0.05)。故芦荟多糖对NK细胞活性有增强作用。

表3　芦荟多糖对小鼠NK细胞活性测定的影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05

3　讨论

芦荟是一种古老而传统的常用中药，国内外研究表明，芦荟多糖具有广谱的调节免疫、抗辐射、抗艾滋病病毒、抗溃疡、降血脂、降血糖、抗氧化等药理活性[11-13]，此外对脑缺血具有保护作用[14-15]。而在众多的药理作用中，芦荟多糖的调节免疫作用受到了最广泛的认可。

人体的免疫反应是一个复杂的细胞学过程，芦荟多糖调节机体免疫的能力不仅能作用于免疫器官，如胸腺、脾脏等，同时能激活免疫细胞，如淋巴细胞、白细胞等，而且有着促进抗体生成等功效，从而起着整体免疫调节作用[3]。巨噬细胞是天然免疫系统重要的效应细胞之一，具有免疫防御、免疫监视、免疫调节以及抗原呈递等多种免疫功能，在机体的免疫系统中起重要作用[16]。自然杀伤细胞是人体质量要的免疫细胞，一方面与免疫调节、抗肿瘤以及抗病毒感染有着密切的关系，另一方面也在某些特定条件下参与机体的超敏反应以及机体自身免疫性疾病的发生。被活化的NK细胞能够分泌并合成TNF-α、TNF-β等多种细胞因子，共同发挥调节免疫以及造血作用，并直接杀伤靶细胞。

本实验中，经口给予小鼠不同剂量芦荟多糖30天后，鼠碳粒廓清试验及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)高剂量组与阴性对照组比较，差异均有统计学意义；NK细胞活性测定高、中剂量组与阴性对照组比较，差异具有统计学意义，显示芦荟多糖在单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性两个方面均具有增强免疫功能的作用，其在细胞免疫和体液免疫方面的作用，有待于进一步研究。