福建海参内源微生物多样性分析 及益生菌抑菌机理初探

李 智,黄晓山,郑宝东,2,*,邓凯波

(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350000;2.福建省海洋资源综合加工及安全风险评估工程技术研究中心,福建福州 350000;3.中国爱尔兰国际合作食品物质学与结构设计研究中心,福建福州 350000)

海参被誉为“海产八珍”之首,在我国具有悠久的养殖和食用历史[1]。2013至2016年,福建海参产量年均增长14.1%[2]。产业规模的急速扩张带来的养殖密度过高、水质不稳定等问题,导致海参染病率增加问题凸显[3],且南北方养殖环境差异明显,传统的广谱抗生素和化学药物滥用现象严重制约了海参产业的健康、可持续发展[4-5]。而微生态制剂通过向饲料中添加活性微生物维持肠道平衡来改善宿主状态,益生菌能与宿主、环境之间形成动态平衡,有利于宿主的健康生长[6-7],是一种绿色无污染的新型疾控手段。利用内源性益生菌较强的抗养殖环境胁迫能力和海参体内定植能力优势,将有效提高其抗病效果。目前,有关海参微生物菌群分析的报道仅局限于辽宁、河北、山东等北方养殖地区[8]。近年来,国内海参养殖呈现“北参南养”的局面,福建是南方的主产区,针对福建海参微生物群落结构的研究和内源益生菌的开发具有重要的理论意义和经济价值。

芽孢杆菌是一种微生态制剂的重要来源菌,其中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是中国农业部公布的12种饲料级微生物添加剂之一[9],而解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的研究表明其部分抗菌活性物质与枯草芽孢杆菌相似[10-11]。抗菌脂肽为芽孢杆菌中最常见的抑菌物质,主要为表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)与丰原素(Fengycin)[12-15]。抗菌脂肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、霉菌以及酵母菌均有抑制作用,具有抗菌范围广、安全高效、易降解、不易产生抗药性等特点[16-18]。因此,抗菌脂肽在农业、食品、生物防治等领域显示出重要的开发和应用前景[19-20]。Meen等[21]研究发现,Iturin和Fengycin对病原真菌生长起抑制作用,而Surfactin具有广泛有效的抑菌活性。马树瑞等[22]从海参肠道中筛选出枯草芽孢杆菌HS-A38,从该菌株发酵液提取的粗品中分离出两种直链脂肽类化合物,对致病菌有明显抑制作用,但并未明确脂肽化合物的具体成分。田良等[23]研究发现,以海参消化道提取出的芽孢杆菌X3-3、X4-1及X4-5作为海参饲料添加剂,可显著提高海参消化道内淀粉酶与蛋白酶活性,促进海参生长,但并未分离确定其功效成分。

因此,本研究拟采用16S rDNA序列比对和生物群落丰度分析手段研究福建海参肠道内源微生物,并以对海参致病菌的抑菌谱和抑菌能力为评价指标,筛选其中的潜在益生菌,对提取的抗菌脂肽类物质进行进一步评价分析,以探明其抑菌机理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成年海参 取样自福建省宁德市霞浦海参养殖场;2216E培养基:蛋白胨5.0 g,酵母膏1.0 g,磷酸高铁0.1 g,陈海水1000 mL;2216E固体培养基另加15 g琼脂;抽提细菌基因组DNA试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;硅胶板(Si60 F254) 默克化工技术(上海)有限公司;表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、丰原素(Fengyci) 标准品,美国Amresco公司。

BSA224S型分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;SW-CJ-2FD型超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;SPX-250型号恒温培养箱 宁波江南仪器厂;Allegra X-30R Centrifuge高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司;GI100DS型高压灭菌锅 厦门致微仪器有限公司;DHG-9145A型鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;FDU-1200型冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海参肠道菌群的分离纯化 将取自福建霞浦养殖场的成年海参20只分为两组,S1组为10只健康成年海参,S2组为10只体表病灶相似、质地松软的病参的成年海参(图1)。无菌条件下,75%(v/v)乙醇溶液擦拭体表后,用手术刀划开海参体表取出整段肠道,无菌生理盐水(0.9%(w/v)NaCl溶液)擦拭肠道外壁。然后将肠道剪碎后放入灭菌研钵,加入少量4 ℃的无菌生理盐水研磨均匀。取研磨后的混合物倒入装有2216E液体培养基的锥形瓶中,27 ℃的恒温培养箱中静置培养4 d。吸取1 mL混匀的培养物,使用无菌生理盐水做梯度稀释后,涂布于固体2216 E海水固体培养基上,每个梯度做三个平行,将涂布的平板放入27 ℃培养箱中静置培养3 d。根据菌落形态、颜色及大小差异挑取菌落,分别在2216E固体培养基上划线培养,对海参肠道菌株进行分离纯化,并分别与甘油混合置于-80 ℃保存备用。

1.2.2 海参肠道菌株16S rDNA测序及菌株多样性分析 取纯化后菌株活化后,采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各菌株基因组DNA,并采用27F和1492R引物进行16S rDNA序列扩增,经回收纯化后将目标序列送至铂尚生物工程(上海)股份有限公司测序。然后将拼接好的16S rDNA序列提交至NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GenBank核酸数据库进行Blastn比对及同源性鉴定。采用ClustalW软件进行多序列匹配排列,MEGA7软件构建系统发育树,并对潜在益生菌及致病菌进行多样性分析。

1.2.3 海参肠道内潜在益生菌的体外抑菌实验 采用牛津杯法[24]进行体外抑菌实验,选取海参肠道内提取出的8株典型致病菌为指示菌,以其潜在益生菌为拮抗菌。将2个灭菌牛津杯置于均匀涂布了0.6 mL指示菌菌悬液(OD600=0.3)的2216E固体培养基上后,在其中一个牛津杯中加入200 μL的新鲜拮抗菌菌悬液(OD600=0.6),另一个牛津杯中加入200 μL的无菌生理盐水做空白对照。将平板置于28 ℃培养箱中培养24 h后,测量抑菌圈直径。

1.2.4 海参肠道内潜在益生菌的抗菌脂肽类化合物提取 采用酸沉淀法[]提取筛选后抗致病菌的益生菌内的脂肽类化合物。将新鲜的细菌发酵液在4 ℃下10000 r/min离心20 min,上清液用6 mol/L HCl调pH至2.0,放置于4 ℃冰箱过夜,10000 r/min离心20 min弃上清后,加适量甲醇对沉淀进行充分溶解,静置0.5 h后10000 r/min离心10 min,上清液用微孔滤膜(D=0.22 μm)过滤后,置于60 ℃烘箱中至大部分甲醇挥发,对样品进行冻干处理,得到脂肽类化合物的粗提物。

1.2.5 脂肽类粗提物对海参肠道典型致病菌的生长抑制作用 选取2株海参肠道内典型致病菌,以10%(v/v)的接种量接入100 mL 2166E液体培养基中,混合均匀后取10 mL培养液分别加入若干无菌空试管中。将提取出的脂肽类粗提物分别用甲醇稀释至1 mg/mL制成粗提物溶液,分别取500 μL粗提物溶液加入上述致病菌培养液试管中,并以甲醇做空白对照,硅胶塞封口后于28 ℃中振荡(110 r/min)培养12 h。使用比浊法测定菌液浓度,取0、1.5、4、6.5、9和12 h的菌悬液,在波长600 nm下测定菌悬液的吸光光度值。以其OD600值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制生长抑制曲线。

1.2.6 抗菌脂肽粗提物薄层色谱(Thin-layer chromatography,TLC)分析 根据庄国宏[26]方法并稍作修改,将硅胶板置于110 ℃烘箱中活化30 min并确定点样线后,在层析缸内加入层析剂(三氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸∶水=65∶15∶5∶2 (v/v/v))预展30 min。用少量甲醇溶解脂肽粗提物样品及标准品,毛细管蘸取样品在点样线上点样,两样品间距1.5 cm,待点样处干燥后置于层析缸中展开,至硅胶板上端距离约1 cm处为展开终点。色谱结束后,将硅胶板置于装有2 mL浓盐酸(37.5%(v/v)HCl溶液)的小烧杯的密闭容器内,110 ℃烘箱中酸解2 h,取出后,硅胶板冷却,将盐酸吹净,喷洒0.4%(v/v)茚三酮显色剂,放入110 ℃烘箱中15 min进行显色。

1.3 数据处理

本文所进行实验均为三次重复结果,并采用Microsoft Excel 2010软件进行显著性分析,以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 海参内源菌株分离纯化

将稀释的种子培养混合物涂布于2216E平板培养基上并培养3 d后,通过肉眼和光学显微镜观察菌落形状、颜色、透明度、聚落等情况。从平板上挑选生长良好,未染杂的且具备一定差异性的菌落,将其进行平板划线培养,纯化后分别保存。本研究从海参肠道中分离纯化共95株优势菌株。

2.2 菌株16S rDNA鉴定与微生物群落结构分析

将95株优势菌株的16S rDNA序列通过PCR手段扩增并纯化后测序,使用16S rDNA,得到各菌株的拼接序列。将其提交到NCBI网站进行Blastn比对,根据序列相似性(>95%)确定菌株种属。95株优势菌株中,共分离出潜在益生菌31株,潜在致病菌株37株及普通肠道菌27株。并在属水平上对健康参组(S1)和病参组(S2)中进行肠道附生微生物群落结构比较分析(见图2)。

如图2所示,从两组海参肠道样本中挑选的菌株由11个细菌属组成,分别为芽孢杆菌属(Bacillus)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、海单胞菌属(Marinomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、希瓦氏菌属(Shewanella)、海杆菌属(Marinobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假海源菌属(Pseudidiomarina)、弧菌属(Vibrio)和Oceanisphaera菌属。在S1中,以芽孢杆菌属和假单胞菌属丰度最高,分别占菌株总数的36.96%和17.39%;在S2中,以假交替单胞菌属和芽孢杆菌属丰度最高,分别占菌株总数的30.61%和28.57%;S1中的海杆菌属在S2中并未发现,S2中的弧菌属和假海源菌属在S1中并未发现;同时,S2中假交替单胞菌属和不动杆菌属的丰度远高于S1。其中,芽孢杆菌属被公认多为海参生长潜在益生菌,并广泛用于微生态制剂开发中[23];有报道指出,假交替单胞菌属、弧菌属、不动杆菌属、海杆菌属和假单胞菌属为海参潜在致病菌[27]。因此可见病参组中潜在致病菌丰度较高,而芽孢杆菌丰度较健康参组低。本研究海参样品的微生物群落仅包含11个可检测菌属,与其他相关报道[27]中菌属数量相比相对较少,这可能与样品养殖环境有关。样品取自福建霞浦吊笼养殖场,海参生活环境、饲料组分及微生态制剂的使用都会对海参肠道内微生物的组成产生影响[28]。

本研究同时发现福建养殖刺参与北方海参肠道优势菌群具有一定差异。张文姬等从大连地区仿刺参肠道分离得到的细菌中,共有10个菌属,优势菌属为假单胞菌属、弧菌属和芽孢杆菌属,分别占总菌株数的33.3%、24.8%和22%;Zhang等[27]从日本海域刺参、底泥及海水中分离得到53个菌属共计1133种菌株,分别属于厚壁菌门、变形菌门及放线菌门,但并未分离到弧菌属。

2.3 海参内源潜在益生菌的体外抑菌作用分析

根据2.2中S1组与S2组的微生物群落结构差异,选取不动杆菌属、假单胞菌属和海杆菌属等3个属共8株海参潜在致病菌为指示菌。其中,不动杆菌属在病参组的含量高于健康参组,海杆菌属、恶性假单胞菌(假单胞菌属)为海参致病菌之一[27,29]。对海参内源潜在益生菌进行抑菌能力初筛后,选取10株以芽孢杆菌为代表的典型益生菌作为拮抗菌株,采用牛津杯法对其体外抑菌能力进行测评(表1)。

表1 福建海参内源益生菌对致病菌的抑菌作用Table 1 Bactriostasis of endogenous probiotics on pathogens of Fujian sea cucumber

以抑菌圈平均直径和抑菌谱为双重指标,对各拮抗菌株的抑菌能力比较可知,抑菌种数达到5株及以上的典型益生菌共有四株,分别为YD1、YK5、YK7和YY8,其中YK7和YY8的抑菌圈平均直径仅为11.76和11.22 mm,抑菌效果相对较差。而YK9的抑菌圈平均直径虽达13.95 mm,但抑菌种数仅为3株,抑菌谱较窄。因此,综合比较筛选出海参附生芽孢杆菌YD1和YK5的相对抑菌能力较强,对各指示菌的抑菌圈形态见图3。

图3 内源益生菌YD1和YK5对海参致病菌抑制作用的抑菌圈展示Fig.3 Illustration of inhibition zone of endogenous probiotics YD1 and YK5 on pathogens from Fujian Apostichopus japonicus

经16S rDNA序列扩增及测序确定YD1和YK5分别为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(图4)。

图4 福建海参内源芽孢杆菌YD1 和YK5种属鉴定系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of endogenous Bacillus YD1 and YK5 from Fujian Apostichopus japonicus注:采用MEGA 7.0软件基于Tamura-Nei模型的 最大似然法作树,Bootstrap value=500。

2.4 内源芽孢杆菌YD1和YK5脂肽类粗提物对典型致病菌的生长抑制作用

提取具有较强抑菌能力的解淀粉芽孢杆菌YD1和枯草芽孢杆菌YK5的脂肽类化合物,并对粗提物的抑菌作用进行对比研究,以本研究分离的典型致病菌恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)ZE4和ZE5为指示菌,以甲醇为空白对照组,抑菌结果如图5所示。与甲醇对照组结果比较,随着培养时间的延长,从9 h开始,ZE4菌悬液的OD600值呈现出显著差异(p<0.05)(图5A和5C),YD1和YK5的脂肽提取物对ZE4的生长产生明显的抑制作用;从6.5 h开始,ZE5菌悬液的OD600值呈现出显著差异(p<0.05)(图5B和5D),YD1与YK5的脂肽提取物对ZE5的生长产生明显的抑制作用。结果显示,虽然抑菌效果有差异,但YD1和YK5的脂肽类粗提物对ZE4及ZE5的生长均具有抑制作用。该结果表明,解淀粉芽孢杆菌YD1和枯草芽孢杆菌YK5的脂肽类代谢产物有抑制致病指示菌生长的效果。

图5 内源性益生菌脂肽类粗提物对致病菌的生长抑制作用Fig.5 Growth inhibition effects of lipopeptide extraction of endogenous probiotics on pathogens注:(A)、(C)为以ZE4为指示菌,(B)、(D)为以ZE5为指示菌;“*”表示与同时间空白组 结果差异显著(p<0.05);“**”表示与同时间空白组结果差异极显著(p<0.01)。

2.5 薄层色谱(TLC)分析

由芽孢杆菌YD1和YK5脂肽类代谢产物的薄层色谱结果可知(图6),使用茚三酮对硅胶板进行喷洒染色并放入烘箱烘干后,YD1和YK5在对应位置处(点A)均呈现为单一的褐色斑点,样品与标准品Surfactin的相对迁移率Rf基本一致(Rf=0.75)。Fengycin、Iturin与Surfactin的相对分子质量均在1000～1500范围内[30],Fengycin和Iturin标准品也在A处附近呈现明显的褐色斑点,说明其相对迁移率与Surfactin及样品脂肽的基本一致。可初步认定两菌株的代谢产物含有Fengycin、Iturin、Surfactin中的一种或多种脂肽类物质,且均为含有亲水性成分的环脂肽类化合物[31]。

图6 芽孢杆菌YD1和YK5脂肽类代谢产物TLC结果Fig.6 Thin-layer chromatogram of lipopeptides metabolized by Bacillus YD1 and YK5

3 结论

本研究从福建海参肠道中提取95株优势菌株,其中,共分离出潜在益生菌31株,潜在致病菌株37株及普通肠道菌27株。通过微生物群落结构分析发现,病参肠道中假交替单胞菌属和不动杆菌属等典型致病菌丰度较高,芽孢杆菌丰度较低,是正常组海参与患病组海参的主要差异,可能是导致福建海参疾病的原因之一。

使用牛津杯法抑菌实验,以抑菌能力为指标筛选出两株抑菌效果明显且抑菌谱较广的菌株,经16S rDNA测序及比对确定其为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)YD1和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)YK5。研究了上述两株芽孢杆菌的脂肽类代谢产物对海参内源致病菌的抑菌作用,发现其对致病菌生长均有良好的抑制作用,证明了其抑菌机理与脂肽类化合物有关,且为含有亲水性成分的环脂肽类化合物。

本研究对构建新型益生菌,开发新型微生态制剂以及海参养殖产业的健康,可持续发展提供了重要的理论依据。