盐析和双水相萃取法 纯化细菌木聚糖酶的比较研究

汤回花,滕 超,2,*,刘丹蕾,鹿发展

(1.食品质量与安全北京实验室,北京工商大学食品学院,北京 100048;2.北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京工商大学食品学院,北京 100048)

木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分,约占植物细胞干质量的15%～35%[2]。作为一种杂和多聚分子,木聚糖结构复杂,含有不同类型的糖苷键以及多种支链取代基,因此要彻底降解木聚糖需要多种酶的协同参与,其中起主要作用的是β-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanohydrolase,EC 3.2.1.8),简称木聚糖酶[3],它能随机地断开木聚糖主链上的糖苷键将其彻底水解为木糖、木二糖及木寡糖。在食品、饲料、造纸等方面具有重要的应用价值[4],是一种重要的工业应用酶制剂[4-6]。

微生物发酵产生的木聚糖酶比较复杂,尤其是细菌产的木聚糖酶属于胞内酶,粗酶液中一般含多种酶蛋白及其他大分子物质,为精准考察某单一酶性质,通常需要对粗酶液进行分离提纯。目前用于蛋白质分离纯化的方法一般有盐析法、双水相萃取系统(ATPS)、离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析和亲和层析等[8],其中双水相萃取是一种比较新颖的初级纯化方法,国外通过双水相技术纯化木聚糖酶的研究已受到较多研究者的关注[9-10],而国内此方面研究还相对较少。作为一项较有应用前景的初步分离除杂技术,双水相萃取系统具有设备要求简单、可连续操作、易于放大和条件温和等特点[11]。本实验分别采用盐析法和双水相萃取法两种初级纯化方法对细菌产胞内复杂代谢产物进行纯化效率考察,确定更加适于Paenibacillussp. B1709木聚糖酶初级纯化的方法,以期为细菌性木聚糖酶的工业化生产和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

产木聚糖酶类芽孢杆菌Paenibacillussp. B1709 实验室自行筛选保藏;榉木木聚糖(Beechwood xylan) 美国Sigma公司;种子培养液(%):胰蛋白胨1.00、酵母提取物0.50、NaCl0.50、pH7.4,121 ℃下灭菌20 min 实验室自配;基础产酶培养液(%):玉米芯2.00、酵母膏2.00、K2HPO40.25、MgSO40.05、NaCl 0.50,pH7.0,121 ℃下灭菌20 min实验室自配。发酵培养液(%):碳源(80目玉米芯粉)0.8、氮源(牛肉膏)1、K2HPO40.25、MgSO40.05、NaCl 0.50 实验室自配;十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基己二胺(TEMED)、甘氨酸(Glycine) Biomol公司;聚乙二醇(PEG) 国药化学试剂公司;丙烯酰胺、N,N′-甲双叉丙烯酞胺 Biotopped公司;乙酸、乙酸钠、过硫酸铵、硫酸铵、柠檬酸、柠檬酸三钠、盐酸等 北京化学试剂公司;其余试剂 均为国产分析纯。

SE600型垂直电泳槽 美国GE公司;EPS-601型电泳仪 美国GE公司;LhS-150SC型恒温恒湿箱 上海一恒科技有限公司;pH计 上海仪电科学仪器有限公司;高速冷冻离心机 日本 hitachi公司;可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液的制备 菌种活化:按比例配制一定量LB固体培养基,高压灭菌(121 ℃,20 min),平板冷却后将保藏于甘油管中B1709菌种进行接种,置37 ℃培养箱中培养。

挑取菌种接入种子培养液,37 ℃、180 r/min培养14 h,将培养好的种子培养液按一定比例接入基础产酶培养液中37 ℃、180 r/min培养24 h,,取其2%的种子培养液接种于50 mL发酵培养液中,37 ℃,180 r/min条件下,摇瓶发酵72 h。发酵结束后,用纱布过滤,滤液8000 r/min离心10 min,收集上清液即为粗酶液。

1.2.2 硫酸铵分级沉淀 硫酸铵分级沉淀方法参照蛋白质手册[12]。准确量取一定体积的粗酶液,在冰水浴中(0～4 ℃)中慢速均匀搅拌,缓慢添加经干燥并研磨的硫酸铵粉末至粗酶液中,使酶液中硫酸铵饱和度达20%。结束后10000 r/min离心10 min,测定上清酶活力和蛋白含量,沉淀用少量缓冲溶液溶解。

准确量取上述离心所得上清液(1 L),重复以上操作至30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%硫酸铵饱和度,测量各饱和度条件下上清液的木聚糖酶活和蛋白含量。

1.2.3 双水相体系制备 选择体系总质量为10 g的双水相体系,按所需比例加入PEG、无机盐、NaCl等试剂,高纯水加热溶解,系统pH用盐酸或氢氧化钠调整,加入1.5 mL粗酶液,不足部分以水补充。离心(3000 r/min)5 min使其上下相分离,记录上下相体积,并测定上下相木聚糖酶活性和蛋白质浓度。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 考察PEG不同分子量对粗酶纯化效果的影响 采用 1.2.3方法对粗酶进行纯化,萃取条件为:固定萃取条件为PEG浓度20%、磷酸氢二钾浓度10%、pH7.0,考察PEG不同分子量(1000、2000、4000、6000、8000 Da)对粗酶纯化效果的影响。

1.2.4.2 考察PEG浓度(对粗酶纯化效果的影响 采用 1.2.3方法对粗酶进行纯化,固定萃取条件为PEG分子量为4000、磷酸氢二钾浓度10%、pH7.0,考察PEG浓度(16%、18%、20%、22%、24%、26%)对粗酶纯化效果的影响。

1.2.4.3 考察pH对粗酶纯化效果的影响 采用 1.2.3方法对粗酶进行纯化,固定萃取条件为PEG分子量为4000、PEG浓度22%、磷酸氢二钾浓度10%,考察pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)对粗酶纯化效果的影响。

1.2.4.4 考察无机盐种类对粗酶纯化效果的影响 采用 1.2.3方法对粗酶进行纯化,固定萃取条件为PEG分子量为4000、PEG浓度22%、pH6.0,考察无机盐种类(硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸钠)对粗酶纯化效果的影响。

1.2.4.5 考察硫酸铵浓度对粗酶纯化效果的影响 采用1.2.3方法对粗酶进行纯化,固定萃取条件为PEG分子量为4000、PEG浓度22%、pH6.0、无机盐为硫酸铵,考察硫酸铵浓度(14%、16%、18%、20%、22%、24%)对粗酶纯化效果的影响。

1.2.4.6 考察NaCl浓度对粗酶纯化效果的影响 采用 1.2.3方法对粗酶进行纯化,固定萃取条件为PEG分子量为4000、PEG浓度22%、pH6、硫酸铵浓度18%,考察NaCl浓度(0、2%、4%、6%、8%、10%)对粗酶纯化效果的影响。

进行单因素实验,考察各因素变量对粗酶纯化效果的影响。

1.2.5 木聚糖酶活力的测定 采用DNS法测定木聚糖酶活力[13-14],木聚糖酶活力定义:在55 ℃,pH7.0条件下,每分钟反应生成1 μmol的还原糖(以木糖计)所需要的酶量为一个酶活单位(1U)。比酶活定义为1 mg蛋白所具有的酶活单位(U/mg)。

1.2.6 蛋白含量的测定 采用BCA法[15]进行蛋白含量测定,标准蛋白为牛血清蛋白,测定蛋白样品在在595 nm下的吸收值,根据标准曲线计算其中的蛋白含量。

1.2.7 双水相萃取相关指标的计算

相比=上相体积/下相体积;

酶分配系数=上相酶活/下相酶活;

纯化倍数=上相比酶活/原酶液比酶活;

酶活回收率(%)=上相总酶活/原酶液总酶活×100

1.2.8 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳及酶谱分析 利用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化过的酶液进行纯度检测,其中分离胶浓度为12.5%(w/v),浓缩胶配制浓度为4.5%(w/v),染色液为考马斯R-250。木聚糖酶酶谱参考Maki[16]的方法。

1.3 数据处理

每组实验重复3次,结果以均值±标准差表示。采用DPS软件对实验数据进行分析,显著性水平(p<0.05)。图形制作采用Excel软件数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 蛋白质的标准曲线

由上述实验方法,在λ=595 nm处测得不同质量浓度标准蛋白溶液的吸收值制作的标曲线见图1,y=0.2637x+0.0013,相关系数R2=0.9991,表示线性良好。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

2.2 硫酸铵分级沉淀

通过测定各盐析条件下上清液的总酶活及蛋白质含量,得到变化曲线,见图2。

图2 硫酸铵沉淀上清液总木聚糖酶酶活力 及总蛋白质含量的变化曲线Fig.2 Effect of ammonium sulphate contenton the total xylanase activity and the protein content of filtrate after precipitation

从图1可以看出,在盐析过程中酶活力在硫酸铵饱和度为0%～30%内变化不明显,直到40%时,在蛋白质含量继续下降的同时,木聚糖酶活力也开始有所下降,说明此阶段主要是部分杂蛋白被沉淀下来;当饱和度超过40%后,上清中木聚糖酶活力开始迅速下降,蛋白含量也迅速降低,当硫酸铵饱和度达到80%时,上清液中基本检测不到酶活力,说明此时木聚糖酶蛋白已经几乎全部被沉淀下来;在此阶段,木聚糖酶蛋白得到了较好的浓缩,同时起到了去除部分杂蛋白的作用。

根据硫酸铵实验盐析结果,最终选取40%作为起始饱和度,80%作为终止饱和度。采用此起始和终止浓度直接对木聚糖酶粗酶液分级沉淀,沉淀用pH7.0的缓冲液复溶后,测定酶活和蛋白质含量结果见表1。

表1 木聚糖酶硫酸铵盐析结果Table 1 Result of xylanase ammonium sulfate fractionation

2.3 双水相萃取木聚糖酶单因素实验

2.3.1 PEG分子量对粗酶纯化效果的影响 由表2可知,5个分子量的聚乙二醇中,PEG 1000体系未成相,无法对粗酶液进行萃取分离,PEG 2000、4000、6000、8000均可以成相,在PEG分子量为4000 Da时,酶的分配系数、蛋白纯化倍数,酶活回收率均为最好。因为PEG分子量通过改变聚合物与蛋白质疏水区域之间的疏水相互作用影响蛋白质在双水相系统中的分配,PEG分子量变高会使得PEG与酶分子之间的疏水相互作用增大,使蛋白质更好的分配于上相,提高回收率,但是PEG分子量过大会造成聚合物空间位阻增大,蛋白分配系数和回收率也会随之下降[17]。

表2 PEG分子量对木聚糖酶萃取效果的影响Table 2 The effect of PEG molecular weight on xylanase extraction

2.3.2 PEG 4000浓度对粗酶纯化效果的影响 由表3可知,在这六个浓度梯度下,双水相体系均可成相,随PEG4000浓度的增大,分配系数K值也呈增大趋势。这是因为对于一定分子量的PEG,当其浓度增加时,双水相中的亲水基团增加,两相差别增大,有利于目标物的分离。但PEG浓度在双水相中不宜太高,一方面提高了操作成本,另一方面,PEG4000浓度的增大,上相自由体积减小,导致上相中的蛋白质减少[18]。因此在PEG4000浓度为22%时达到最佳萃取效果。

表3 PEG4000浓度对木聚糖酶萃取效果的影响Table 3 The effect of PEG concentrationon xylanase extraction

2.3.3 pH对粗酶纯化效果的影响 双水相体系的pH也是影响分配系数的关键因素,为探究体系pH对萃取效果的影响,将双水相体系的pH调至5.0～9.0范围内,结果如表4所示,在pH为5.0时,体系无法成相,pH为6.0时,萃取效果最佳,之后随着pH的增大,木聚糖酶回收率开始降低,萃取效果下降,在pH为9.0时,回收率已下降到43.48%。因为pH的变化会造成目标蛋白质和杂质的带电性、离子组成和表面特性的改变,进而影响蛋白在上下相间的分配特性[19]。

表4 pH对木聚糖酶萃取效果的影响Table 4 The effect of pH on xylanase extraction

2.3.4 无机盐种类对粗酶纯化效果的影响 为考察不同无机盐对萃取效果的影响,选取硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸钠四种无机盐分别在三个浓度条件下对萃取效果的影响。由表5可知,四种无机盐对体系成相表现出差异,因为不同的盐类带有的正负离子不同,会影响酶在双水相体系中的分配,并且盐的种类和浓度还会使得蛋白质的表面疏水性改变,造成蛋白质两相间分配平衡的变化[20]。磷酸氢二钠浓度为10%时,无法与PEG4000成相,其中在三个浓度下,硫酸铵与PEG 4000成相时,酶活回收率和纯化倍数均处于较高水平,其中以硫酸铵作为成相无机盐时,蛋白纯化倍数相对最大,回收率也很高,在90%左右,因此,选择硫酸铵作为成相盐进行后续实验。

表5 不同无机盐木聚糖酶萃取效果的影响Table 5 The effect of inorganic salt on xylanase extraction

2.3.5 最适硫酸铵浓度的确定 由表6可知,木聚糖酶的回收率和纯化倍数在硫酸铵浓度为18%时,纯化倍数为4.5,回收率为94.15%,此浓度下达到最佳萃取效果,之后随着硫酸铵浓度增加纯化倍数变化较小,但回收率急剧下降,因为过高浓度的盐会造成蛋白质在相界面沉淀,因此最终选取18%作为最适成相盐浓度。

表6 硫酸铵浓度木聚糖酶萃取效果的影响Table 6 The effect of(NH4)2SO4concentration on xylanase extraction

2.3.6 NaCl浓度对粗酶纯化效果的影响 已有研究表明在双水相体系中加入中性盐可以加速相分离和改变蛋白质的疏水性,可以很好的有助于酶的萃取[21]。结果如表7所示,在加入氯化钠的体系中,木聚糖酶回收率和纯化倍数呈现逐渐降低趋势,与未加入氯化钠的体系对比可知,在体系中加入2%的氯化钠可达到最佳萃取效果,此时蛋白纯化倍数显著提高,达到6.13,是盐析法的3.44倍。

表7 NaCl浓度对木聚糖酶萃取效果的影响Table 7 The effect of NaCl concentration on xylanase extraction

2.2.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳及酶谱分析 将经过盐析纯化的粗酶液和双水相萃取纯化的粗酶液进行SDS-PAGE电泳及酶谱分析检测纯度。电泳结果如图2显示,发酵粗酶液经盐析纯化后,显示有许多杂蛋白,双水相萃取后纯度效果较好,有利于后续的纯化。经酶谱分析,菌株B1709粗酶液可以产生多个木聚糖酶,而经盐析及双水相萃取后,非目标酶蛋白减少甚至完全去除(如图2所示)。通过对目标蛋白进行分子量粗测,目标蛋白的分子量大约为17 kDa。目前工业生产的大多为霉菌来源的木聚糖酶,其最适反应温度大多在50～60 ℃左右,最适pH多为中性偏酸,大大制约了木聚糖酶在造纸工业中高温高碱环境下的应用[20-22]。因此,Paenibacillussp. B1709进一步丰富了木聚糖酶资源,在工业上具有广泛的应用前景,尤其适用于造纸工业中的生物纸浆及生物漂白[25]。相关文献报道[26]低分子量的细菌性木聚糖酶酶解底物时,最初的酶降解产物主要为链较长的寡聚糖,适用于低聚木糖的工业化生产。

图3 初级纯化电泳图及酶谱Fig.3 SDS-PAGE and zymogram of primary purification注:1:标准蛋白Maker;2、5(酶谱):发酵粗酶液;3、6(酶谱):盐析纯化粗酶液;4、7(酶谱):双水相萃取纯化的酶液。

3 结论

实验将硫酸铵盐析和双水相萃取对Paenibacillussp. B1709木聚糖酶初级纯化进行比较,结果显示盐析法可将木聚糖酶的纯化倍数从粗液的1.00提升为1.78,而通过双水相萃取法可达6.13,是盐析法的3.44倍。可见,双水相萃取法较适于作为层析纯化的前导处理手段,可有效减少纯化过程中目标蛋白流失,在经济适用的前提下有效规避盐析法的弱点。实验结果显示双水相萃取在大规模纯化尤其针对复杂纯化目标时具备一定技术的优势,可为类似研究提供一定的实验参考。