双孢菇菇柄多糖柱层析纯化及单糖组成

李顺峰,王安建,田广瑞,刘丽娜,魏书信

(河南省农业科学院农副产品加工研究中心,河南郑州 450002)

近年来,关于食用菌及食用菌多糖提取物调控人体免疫系统、抑制肿瘤细胞生长、镇痛、抗氧化、抗疲劳等相继被报道,而这些功能均与其含有的多糖类物质相关[1-7]。从多糖的组成和结构来看,多糖本身或者多糖与蛋白质结合都表现出一定的生理活性,而不同的单糖成分、主链糖苷键连接方式、支链的分枝数目以及多糖的空间构象,也会对其药理作用产生一定的影响[3]。因此,多糖的生理活性功能与其单糖组成和单糖连接方式密切相关。Scarpari等[3]也指出,在目前的有关食用菌中β-葡聚糖的纯化方法来看,如果采取的方法不合适,会阻碍结果的标准化,致使其生物学特性给人造成困惑或矛盾。因此,采用正确合理的技术对粗多糖进行纯化,并解析多糖的理化性质、分子量、聚合度、单糖组成和主链糖苷键连接方式等,可有助于分析多糖与其药理作用的关系。

双孢菇,又称白色纽扣蘑菇,是全球栽培面积和消费量最大的食用菌之一。目前,已有研究者针对双孢菇子实体多糖进行了提取和生物活性评价[8-12],其中,双孢菇含有的线性(1→6)β-D-葡聚糖具有促进控制炎症基因表达的功能,从而降低炎症的发生[13];双孢菇菌种深层培养基提取的胞外多糖具有抗氧化和清除自由基的能力[14];同时,双孢菇粗多糖纯化物可以降低恶性肿瘤细胞(Sarcoma 180)的生长[15];而且Ruthes等[16]也首次指出双孢菇含有的海藻半乳糖具有显著抗败血、镇痛和抗发炎的功效;Smiderle等[17]比较了双孢菇(Agaricusbisporus)和巴西蘑菇(Agaricusbrasiliensis)的多糖提取物在结构和免疫调节功能上的差异,结果表明,双孢菇多糖中甘露半乳糖(mannogalactan)含量较高,巴西蘑菇中β-葡聚糖含量较高,而且两种不同蘑菇多糖的单糖组分和比例也各不相同。此外,两种多糖虽然都可刺激促炎症因子的细胞因子和酶的产生,但是巴西蘑菇多糖还能降低促炎细胞的合成,表明它是一种程序化的免疫调节多糖。然而,这些研究并未指明采用的双孢菇材料是否包含菇柄,对于约占双孢菇子实体重量约20%～30%的菇柄而言,生产过程中大多被作为废弃物处理。本研究采用双孢菇菇柄为试材,对菇柄多糖进行柱层析分离纯化及纯度鉴定,并对柱层析得到的多糖组分进行红外光谱分析和单糖组成分析,为双孢菇菇柄多糖的利用和附加值提升提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双孢菇菇柄 洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司;葡萄糖、浓硫酸、重蒸酚、无水乙醇、溴化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等 均为国产分析纯;中性蛋白酶(食品级,10万U/g) 南宁庞博生物工程有限公司;透析袋MD55(截留分子量:3500 Da) 北京索莱宝科技有限公司。

FA2004C型分析天平 上海越平科学仪器有限公司;HN-1000Y型超声波细胞粉碎机 上海汗诺仪器有限公司;H2050R型台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;RV8V-C型旋转蒸发仪 德国IKA集团;UV1800型紫外-可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;LD-Y300A型高速万能粉碎机 上海顶帅电器有限公司;Lyovac GT1型冷冻干燥机 德国SRK系统技术公司;Nicolet is5型傅立叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司;ICS-5000型离子色谱仪 美国黛安公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖样品制备 在参考大量文献资料[4,6,9-10,14,18-21]及前期实验的基础上,综合考虑各方面的因素,确定双孢菇菇柄多糖制备工艺流程为:

双孢菇菇柄用高速粉碎机粉碎(12000 r/min,3 min),过40目筛→80 ℃下用85%乙醇回流脱脂→挥干乙醇→残渣超声波提取(超声波功率700 W、超声提取时间50 min、液固比为20∶1)→合并滤液→浓缩(45 ℃、-0.01 MPa)→乙醇沉淀多糖(无水乙醇∶浓缩液=3∶1)→4000 r/min离心10 min,收集沉淀→沉淀加蒸馏水溶解→脱蛋白(1 mg/mL中性蛋白酶加酶量为0.4倍多糖体积、pH7.0、酶解温度45 ℃、酶解时间3 h)→乙醇沉淀多糖→透析→冷冻干燥(-58 ℃、-0.01 MPa、24 h)得多糖样品。

1.2.2 DEAE Sephadex A-25柱层析分离纯化多糖 DEAE Sephadex A-25经预处理后装柱(Φ1.5×60 cm)、平衡,将多糖样品用蒸馏水溶解后配成浓度为4 mg/mL溶液,取3 mL过柱子。洗脱液分别为蒸馏水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaOH,流速为2 mL/min,每管收集5 mL,每种洗脱液分别收集40管。每管多糖吸光值采用苯酚-硫酸法[22]测定,并以管号为横坐标、吸光值为纵坐标做洗脱曲线图,根据洗脱曲线收集各洗脱组分。

1.2.3 多糖纯度鉴定

1.2.3.1 紫外光谱扫描鉴定多糖纯度 将多糖样品制成水溶液,于200～400 nm下进行扫描,获得紫外区光谱。

1.2.3.2 Sephadex G-200对多糖纯度的鉴定 将经DEAE Sephadex A-25洗脱组分多糖配成2 mg/mL溶液,取2 mL过Sephadex G-200柱,以0.1 mol/L NaCl为流动相,流速为0.5 mL/min,检测多糖纯度。

1.2.4 多糖红外光谱扫描 取多糖样品5 mg,与200 mg经干燥的KBr在玛瑙研钵中研磨均匀,压片后用傅立叶变换红外光谱仪扫描,获得扫描图谱。

1.2.5 多糖的单糖组成分析

1.2.5.1 标准糖测定 将各糖标准品用超纯水溶解,并按一定比例混合后,过0.45 μm微孔滤膜后进行糖组成分析。

色谱条件:色谱柱:CarboPac PA20;流速:0.5 mL/min;检测器:脉冲安培检测器;流动相:水和250 mmol/L NaOH,0～20 min为97.5%水,20～21 min水由97.5%降为20%,之后保持此水平至30 min。

1.2.5.2 多糖样品单糖组成分析 吸取100 μL浓度为4～5 mg·mL-1的多糖样品溶液于5 mL的具塞刻度试管中,加入100 μL的4 mol·L-1三氟乙酸(TFA),充N2封管,110 ℃烘箱中水解2 h;冷却后打开盖,加200 μL甲醇后用N2吹干,如此重复加甲醇并用N2吹3次,去除TFA,将其残渣用水溶解定容至5 mL,用0.45 μm微孔膜过滤后供进样分析。

1.3 数据处理

数据统计与处理采用SPSS 24和Origin 9.2进行分析,所有实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 双孢菇菇柄多糖DEAE-Sephadex A-25柱层析纯化

双孢菇菇柄经粉碎、超声波提取、乙醇沉淀和脱蛋白质后,通过DEAE-Sephadex A-25层析柱进一步分离纯化,自动部分收集器分部收集,以苯酚-硫酸法逐管检测多糖。以管数为横坐标,吸光值为纵坐标作图,洗脱结果见图1所示。从图1可以看出,在洗脱开始,随着洗脱液离子强度的增加会有不同的组分被洗脱出来,用蒸馏水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaOH洗脱时,在490 nm处都出现了吸收峰,其中蒸馏水、0.1 mol/L NaCl溶液洗脱出来的物质量相对较大,将这两个洗脱组分分别收集,加入3倍体积的乙醇于4 ℃过夜醇沉后,于4000 r/min离心10 min,收集沉淀,真空冷冻干燥后分别得到淡黄色、浅褐色粉末,并命名为A-25-1、A-25-2。

图1 双孢菇菇柄多糖DEAE-Sephadex A-25柱层析洗脱曲线Fig.1 Elution profile of polysaccharides extracted from A. bisporus stipe by DEAE-Sephadex A-25

2.2 双孢菇菇柄多糖A-25-1和A-25-2纯度的鉴定

2.2.1 紫外光谱鉴定 分别取10.0 mg经DEAE-Sephadex A-25柱层析纯化后的双孢菇菇柄多糖组分(A-25-1和A-25-2)溶于10 mL蒸馏水,用UV-1800型紫外可见分光光度计进行扫描,扫描结果见图2。由图可知,A-25-1和A-25-2在260 nm和280 nm处均无明显吸收峰,表明经DEAE-Sephadex A-25柱层析纯化后的多糖组分不含核酸和蛋白质等杂质成分。

图2 A-25-1和A-25-2紫外可见扫描图谱Fig.2 UV spectra of A-25-1 and A-25-2

2.2.2 Sephadex G-200柱层析光谱鉴定 A-25-1和A-25-2经过Sephadex G-200凝胶柱层析的洗脱曲线如图3。由图可以看出,双孢菇菇柄粗多糖经DEAE-Sephadex A-25柱层析洗脱后得到的两个组分均为单一的洗脱峰,说明其纯度较高。

图3 A-25-1和A-25-2 Sephadex G-200柱层析洗脱曲线Fig.3 Elution profile of A-25-1 and A-25-2 by Sephadex G-200 eluted with 0.1 mol·L-1 NaCl

2.3 双孢菇菇柄多糖A-25-1和A-25-2红外光谱分析

对样品A-25-1进行红外光谱扫描,光谱图如图4所示。在糖类化合物中,由于存在多个羟基,在3570～3050 cm-1通常出现多个O-H伸缩振动吸收峰,这些吸收峰重叠在一起,形成宽的吸收带,3394.10、3389.28和3247.06 cm-1均位于此吸收带内;1640.16 cm-1吸收峰为C=O伸缩振动的强吸收峰;1414.53 cm-1处的吸收峰为C-H弯曲振动峰;1244.34 cm-1处的吸收峰为酮糖类C-C伸缩振动;另外在1200～1030 cm-1为C-O键的伸缩振动峰,由于多糖分子中C-O键存在多种形式,因此表现出多个分叉峰1146.96、1082.83、1039.93 cm-1,这些都是多糖红外光谱图的典型特征。在1016.30 cm-1处的吸收峰为吡喃糖环醚键C-O-C,919.40 cm-1附近的吸收峰是典型的吡喃糖β型C-H变角振动的特征吸收峰,表明有β-糖苷键,因此初步判断A-25-1样品为吡喃糖环β-异构体的多糖。

图4 A-25-1红外光谱图Fig.4 IR spectrum of A-25-1

对样品A-25-2进行红外光谱扫描,光谱图如图5所示。在官能团区,3420.14 cm-1处表现出典型的分子间缔合羟基的振动吸收峰,吸收峰强度大;2926.93 cm-1处的吸收峰与C-H的伸缩振动相对应,强度较弱;1626.66 cm-1吸收峰为C=O伸缩振动的强吸收峰;1240.49 cm-1处的吸收峰为酮糖类C-C伸缩振动;另外在1200～1030 cm-1为C-O键的伸缩振动峰,由于多糖分子中C-O键存在多种形式,因此表现出多个分叉峰1076.08、1049.57 cm-1,这些都是多糖红外光谱图的典型特征。776.69 cm-1吸收峰为D-吡喃糖环β-异构体的吸收峰,且在888.06 cm-1处有弱吸收峰存在,该峰位于D-吡喃糖环β-异构体δC1-H(891±7) cm-1区间,因此初步判断A-25-2样品为D-吡喃糖环β-异构体的多糖。

图5 A-25-2红外光谱图Fig.5 IR spectrum of A-25-2

综合以上分析结果,经DEAE-Sephadex A-25柱层析所得到的水洗脱多糖和0.1 mol/L NaCl洗脱多糖均含有多糖的特征吸收峰,这一结果与乔德亮等[9]和高宏伟等[23]对双孢蘑菇子实体多糖红外光谱结果一致;并且经柱层析所得两种多糖均为吡喃糖环β-异构体的多糖,这一结果与高宏伟等[23]双孢菇胞内和胞外多糖为β-吡喃糖结果相一致。

2.4 双孢菇菇柄多糖A-25-1和A-25-2单糖组成

取11种单糖配成混合溶液作为标品,将完全水解的多糖样品A-25-1和A-25-2溶于超纯水中,上样测定,获得单糖标品、样品A-25-1和A-25-2的离子色谱图见图6。对比样品与标样的离子色谱图,根据各峰的保留时间获得样品的单糖组成,双孢菇菇柄多糖组分A-25-1由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖组成,其摩尔比为1.00∶19.02∶1.36∶0.65∶0.21。而A-25-2是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖组成,其摩尔比为1.00∶1.52∶0.27∶0.50∶0.39∶0.21∶0.02∶0.01。这一结果表明,所得两种多糖均为杂多糖,这一结果与高宏伟等[23]双孢菇多糖为由单一葡萄糖组成的葡聚糖结果相悖,可能是由于栽培环境和菌种差异等所致,但与武金霞等[21]和王德宇[20]的研究结果双孢菇多糖为杂多糖结果相类似。

图6 单糖标品(A)及样品A-25-1(B) 和A-25-2(C)的高效液相色谱图Fig.6 The HPLC profiles of monosaccharide standards(A)，sample A-25-1(B)and A-25-2(C)

3 结论

所得脱蛋白双孢菇菇柄多糖经DEAE Sephadex A-25柱层析纯化得到两个较多的组分,分别为蒸馏水和0.1 mol/L NaCl洗脱,经紫外光谱扫描无核酸和蛋白质,经Sephadex G-200柱层析鉴定均为单一峰。

经FT-IR红外光谱分析,所得两种多糖组分均为吡喃糖环β-异构体的多糖。双孢菇菇柄水洗脱多糖组分(A-25-1)由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖组成,其摩尔比为1.00∶19.02∶1.36∶0.65∶0.21。而0.1 mol/L NaCl洗脱组分(A-25-2)是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖组成,其摩尔比为1.00∶1.52∶0.27∶0.50∶0.39∶0.21∶0.02∶0.01。