脐带间充质干细胞最佳制备条件的研究

刘雅文

（中源协和生物细胞存储服务（天津）有限公司，天津 300384）

1 UC-MSCs特性

脐带间充质干细胞通常为贴壁生长，形态呈梭状或纺锤状，相对均一[1]。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会制定的最低标准，脐带间充质干细胞需满足以下条件：（1）间充质干细胞在标准培养条件下呈现贴壁生长状态；（2）间充质干细胞表型呈阳性表达CD105-PE、CD73-PE和CD90-PE（≥95%），呈阴性表达CD45-PE，CD34-FITC，CD14-FITC或CD11b-FITC，CD79a-FITC或CD19-FITC和HLA-DR-PE（≤2%）[2]。

2 实验

2.1 实验方法

（1）人脐带样本采集：医生将脐带两端结扎，剪下放于装有脐带采集液的采集瓶中。（2）人脐带组织贴壁法分离：将脐带纵向剪开，用镊子剥去脐带中的两根脐动脉和一根脐静脉，将脐带剪成更小的小块，匀接种于含培养液培养瓶中37 ℃培养（即为P0代细胞）。（3）UC-MSCs传代培养：培养数天，观察细胞形态成纤维状且贴壁细胞占培养瓶底面积在85%～95%时，进行细胞换液分瓶培养即为传代培养。（传代1次即为P1代细胞，以此类推）

2.2 实验分组

实验分为3组，取三份脐带，第一组：脐带4 ℃环境中，保存至第48 h时，进行贴壁分离培养；第二组：脐带保存在-20 ℃环境中，至第8天时复苏，进行贴壁分离培养；第三组：脐带采集后48 h内处理成组织块，保存于冻存液中，液氮中保存至第25天时进行贴壁培养。三组分别观察P2代、P5代细胞形态，并进行表型判定检测。

3 实验结果

3.1 UC-MSCs P2代细胞形态

显微镜下观察脐带组织块周围，培养至第12天时可见脐带块周围有贴壁细胞生长,并开始传代培养。传至P2代，对三组细胞进行细胞显微镜下观察：第一组和第三组显微镜下观察细胞，细胞形态细小梭形，呈现典型的成纤维细胞形态，形态均一，排列整齐。第二组镜下观察细胞形态细长，细胞生长分散杂乱，细胞数量少，形态不均一，如图1所示。

图1 P2代显微镜下细胞形态

3.2 UC-MSCs P2代细胞表型判定检测

P2代细胞表型判定检测结果见表1，第一组CD105-PE低于95%第二组CD73-PE、CD105-PE均低于95%，细胞表型不合格。

3.3 UC-MSCs P5代细胞表型判定检测

细胞培养至P5代细胞表型判定检测，三组细胞检测结果均合格，见表2。

表1 P2代细胞表型判定检测结果

表2 P5代细胞表型判定检测结果

4 结论

通过分别对三组细胞进行P2代形态上的观察，第一组与第三组细胞由于对采集后的脐带及时分离，细胞形态较好生长较快，可见脐带采集后应尽快分离，以确保细胞生长状态良好。

通过对UC-MSCs P2代与P5代细胞表型结果进行比对，可见培养至P5代细胞相对于P2代细胞表型更加稳定，杂细胞少，建议推荐UC-MSCs P5代细胞治疗使用。

[1]翟秀岩,马文锋,热海佐保子,等.培养细胞的冷冻保存和解冻复苏的操作方法[J].中国医科大学学报,2002,31(1):77-78.

[2]徐燕,李长虹,孟恒星,等.人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(32):6289-6294.