抗体药物纯化方法研究进展

翟东改，陈凌，钱平

（江苏苏青生物技术有限公司，江苏无锡 214000）

抗体是由抗原刺激而产生，并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的具有免疫功能的糖蛋白[1]。通常把血清或血浆中的抗体成分称为免疫球蛋白（Ig），不同的重链和轻链组成完整的Ig分子，分别为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE等。抗体药物的生产由于其生物料液的复杂性以及对抗体产品要求的严格性使抗体纯化过程成为了抗体生产的关键，该纯化过程约占抗体药物生产成本的50%～80%。抗体的分离纯化一般分为样品的粗提、粗提物精制、抗体精纯三个步骤[2]，抗体生产的基本流程如图1所示。

图1 抗体生产基本流程步骤[3]

常规的抗体分离纯化方法有盐析法、超滤法、色谱层析分离法等，其中色谱层析方法在抗体纯化过程中应用比较广泛，主要包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤等。亲和层析由于其高选择性、特异性，成为抗体纯化非常有效的方法之一，同时可以减少纯化步骤，缩短纯化时间。

1 常规分离方法

1.1 盐析法

根据不同的蛋白质的疏水性特点，提高盐浓度、增加其疏水性，从而使蛋白沉淀。影响盐析的主要因素为温度、pH、样品浓度。通常盐析法作为抗体的粗提技术，要想获得高纯度的抗体需要与其他的色谱方法结合。

1.2 超滤法

超滤技术是20世纪70年代兴起的一种新的分离技术，该技术成本及能耗低，操作条件温和，特别适用于活性分子的提取。但随超滤的不断进行，膜容易出现污染，需要定期的进行膜清洗，另外在超滤过程中蛋白容易发生聚集。

2 色谱层析方法

2.1 离子交换色谱

利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间的静电相互作用力的差别进行溶质分离[4]。通过调节缓冲液及样品的pH，使抗体带上电荷，与带相反电荷的介质结合，结合在介质上的抗体分子可通过改变洗脱缓冲液的pH或者盐浓度而洗脱下来。离子交换色谱的吸附性能取决于样品的盐浓度，盐浓度过高抗体无法吸附，因此需预先对原料液除盐，降低盐浓度后才可以上柱。另外，过高或者过低pH也容易引起抗体的活性丧失。

2.2 凝胶过滤

根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离，但是其具有选择性低，料液的处理量小（5%CV）等特点，因此常作为精制步骤。

2.3 疏水层析

根据蛋白质与疏水性吸附剂之间疏水相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离。一般是高盐吸附、低盐洗脱。抗体由于其分子中有许多非极性氨基酸（色氨酸、酪氨酸、丙氨酸等），暴露于抗体分子表面的非极性氨基酸侧链可以密集在一起形成疏水区[5]，疏水区与吸附剂结合，达到纯化抗体的目的。

2.4 疏水电荷诱导色谱

疏水电荷诱导色谱（HCIC）的吸附机理是基于对偶模式的离子化配基的pH依赖的行为，配基同时包括疏水基团和弱离子化基团。流动相的pH值在6～9的范围内，配基不带电，配基和间隔臂作为疏水位点，并且通过疏水作用结合蛋白，因此不需要加入盐即可实现对蛋白的吸附。当降低流动相的pH值，配基带上正离子电荷，此时蛋白质也带上净正电荷，由于蛋白质和配基之间的静电排斥作用而发生解吸。最早的吸附剂为Pall公司提供的MEP HyperCel（4-巯基乙基吡啶）。Guerrier等[6]通过MEP HyperCel一步层析分离操作，从腹水或含5%牛血清的细胞培养液中有效捕获抗体，纯度分别达到83%、69%，IgG的动态载量达25～35mg/mL介质[7]。

2.5 亲和层析

亲和层析利用功能分子特定的结构与生物分子可逆的特异性相互识别并结合。常见的结合类型为酶与底物、抗原与抗体。由于其高度的特异性及同时具有浓缩的效果，已广泛用于从大量的复杂溶液中分离少量的特定蛋白质，如抗体。

2.5.1 亲和层析基质

亲和层析是基于抗体分子和偶联在固相基质上的亲和配基之间的特异性识别实现抗体纯化，用于固定配体的固相基质分为天然的固相基质（如琼脂糖、葡聚糖、纤维素）、化学合成的固相基质（如丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯）、无机骨架固相基质（如多孔硅胶、玻璃纤维）。亲和基质的种类及市售代表产品见表1。在过去的几十年中，磁珠作为亲和分离基质备受关注，在1970年逐渐应用到化学，制药及生物技术领域。

2.5.2 配基

目前，抗体亲和纯化介质常用的配基主要有生物活性配基、合成配基、亲和仿生配基。

2.5.2.1 生物活性配基

主要有天然蛋白，如蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、抗原等。

（1）蛋白A于1940年第一次被Verwey从金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞壁中分离，是一种能与人及多种哺乳动物血清免疫球蛋白分子发生非特异性结合的蛋白质。野生型蛋白A基因编码序列由1464个碱基组成（不包括编码N端信号肽的108个碱基），共编码488个氨基酸，分子量约为42 kD。蛋白A从N端至C端依次由S、E、D、A、B、C、X结构域组成。单个结构域均具备结合抗体Fc片段和VH3亚类抗体Fab片段的能力。

（2）蛋白G来源于化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的细胞壁蛋白[17]。蛋白G和免疫球蛋白IgG有较强的结合。与多数哺乳动物的IgG的Fc段结合，与Fab段也有氢键的相互作用，但不结合人IgM、IgD和IgA，与蛋白A相比，具有更广的IgG结合能力。

（3）蛋白L是从消化链球菌（Peptostreptococcusmagnus）中分离出来的蛋白[18]。对于抗体可变区域的Kappa轻链片段（Kappa light chain）有很强的亲和力，能够与免疫球蛋白的k1、k3和k4轻链结合，但不与k2和L轻链（Lambda lightchain）结合，适合于纯化免疫球蛋白的片段，如scFv、Fab、F(ab')2等。目前没有发现蛋白L可以与抗体的Fc段及重链结合。蛋白L结合抗体的种类范围比较宽，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，可以识别50%的人及75%的鼠免疫球蛋白。天然配基及与抗体的结合位点见表2。

表1 亲和基质的分类

表2 天然蛋白配基与抗体的结合位点

（4）凝集素（lectin）是一种从植物或动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，可以与抗体的糖基化位点特异可逆的结合，因此被用来纯化抗体。常用的如伴刀豆球蛋白A（ConA）、小麦胚芽凝集素（WGA）、甘露聚糖-结合蛋白（MBPs）。凝集素一般用来纯化IgD、IgA、IgM，通常中性pH条件下结合，中性条件0.1～0.5M盐浓度下洗脱[22]。最常用的伴刀豆亲和介质在pH7.4条件下对抗体的动态吸附载量最高，在2M盐浓度下90%的抗体可以被完全洗脱，而且在使用10个循环以后，捕获IgG的能力不变[23]。

（5）抗原或者抗体作为配基，整个抗原作为配基的亲和介质可纯化抗体，特异性的肽段作为亲和配基也可以纯化抗体同时模拟抗原的结构或序列的配基也可以实现抗体纯化，但是需要筛选其亲和性能，而且要进一步优化抗体的洗脱条件。单结构域抗体（sdAb）由于其分子量小，高亲和性及稳定性通常用于抗体纯化，但是sdAb其载量较低，因此在纯化工艺中比较受限。

2.5.2.2 合成配基

TAC（Thiophilic adsorption chromatography）又称亲硫色谱、嗜硫色谱。嗜硫色谱介质上配基砜-硫醚基团在一定浓度盐浓度条件下（通常为硫酸盐和磷酸盐），可与抗体表面适当的位点相互作用，通过降低盐浓度洗脱抗体，对抗体和巨球蛋白具有显著的亲和吸附性。Porath在1985年首次用嗜硫色谱从血清中分离出抗体。最早的TAC吸附剂为T-GEL，是琼脂糖经过二乙烯砜（DVS）活化再与2-巯基乙醇（2-ME）作用生成砜-硫醚基团，对IgG的吸附容量为18～28g/L。嗜硫色谱已广泛应用于牛IgG抗体[24]、鸡蛋IgY、F(ab’)2、Fab片段以及大肠杆菌scFvs[25]。另外，磁珠经DVB和VAC处理后，偶联杂环配基如2-羟基吡啶纯化人血清中的抗体，抗体纯度＞94%，生物活性＞99%[26]。

HAC羟基磷灰石层析（hydroxyapatite chromatography，HAC）是以羟基磷灰石为介质的层析分离技术。羟基磷灰石的分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，是一种含钙矿物质。羟基磷灰石上的2个作用位点，其中带负电的PO4的位点可以与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换的特性，可采用盐浓度梯度洗脱；而带正电Ca2+位点可与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合[27]。HAC与蛋白A、蛋白G一样可一步纯化IgG，也可以用于IgA、IgM的捕获，载量10～20mg/mL，纯度＞90%。通常在用盐浓度梯度洗脱目标时时加入PEG，可更好的去除聚集体、宿主蛋白、DNA、内毒素以及病毒[28]。

IMAC固定化金属螯合亲和层析主要利用暴露的蛋白质残基（组氨酸、赖氨酸、色氨酸等）和介质上的金属离子（铜、锌、钴、镍等）之间的相互作用不同而分离蛋白质。IMAC可以用来纯化不同物种的抗体以及不同抗体的亚种，主要用于分离一些通过基因工程手段获得的带有氨基酸残基的抗体片段，如scFv。IMAC的配基通常为NTA、IDA，中性条件下结合，通过改变pH或者竞争吸附（咪唑）进行洗脱。

硼酸亲和层析主要是利用硼酸或其衍生物作为配基，与抗体Fc片段的多聚糖结合，完成抗体纯化。硼酸亲和具有低成本，高稳定性以及通过改变pH条件快速将抗体洗脱解离的优点。

2.5.2.3 亲和仿生配基

随着蛋白晶体解析技术的快速发展和计算机分子模拟技术的不断进步，亲和仿生配基技术得到了强有力的支撑，通过分子模拟对蛋白结构和潜在的配基结合位点进行分析，采用分子对接和分子动力学模拟等手段设计和筛选出潜在的配基[29]。目前，应用比较广泛的亲和仿生配基为化学合成仿生配基和短肽仿生配基。

化学合成仿生配基是通过化学方法合成亲和仿生配基，分子量相对较小，与目标蛋白具有一定的亲和性，而且能够以共价键的形式偶联到基质上。目前，化学合成配基主要为基于三嗪结构的配基[30-33]和多组分反应合成的配基[34-35]。Li等[33]以蛋白A作为模板，设计了基于三嗪类的仿生配基。通过分析蛋白A与IgG-Fc片段复合物的晶体结构，确定二者间的特异性识别位点，以关键残基Phe132-Tyr133二肽作为模板设计仿生配基Ligand 22/8，将其偶联到琼脂糖基质上用于分离血浆中的抗体，吸附容量可达到50 mg/g介质以上，抗体收率大于60%，纯度大于92%，且该介质可以在1mol/LNaOH中保存7天[30]。基于该配基的商业化介质MabSorbentA1P和A2P，已应用于单克隆抗体和Fc融合蛋白的分离纯化，可以达到蛋白 A 亲和层析的效果。

短肽仿生配基是以氨基酸作为原料，通过设计、筛选和优化保证与目标蛋白的亲和性的小肽。分为线性肽、环肽、多聚肽配基。Yang等[36]在IgG的Fc片段构建了以N端开始依次为组氨酸-芳香族氨基酸-碱性氨基酸的六肽库，利用组合化学进行筛选，得到了特异性结合Fc片段的六肽配基HWRGWV，可纯化人、牛、鼠、羊、兔的IgG。Fassina等[37]通过筛选多聚肽库，得到特异性识别IgG的Fc片段多聚肽，命名为TG19318。TG19318亲和柱能在中性低离子强度缓冲液中吸附抗体，与从细胞培养上清获得的原始料液的物化性质完全兼容，用pH3.0醋酸溶液或pH9.0碳酸氢钠溶液调节缓冲液pH值至酸性或弱碱性，就能洗脱吸附的抗体。TG19318比蛋白A具有更广泛的特异性，不仅能纯化IgG，还能纯化IgY、IgM、IgA和IgE。

3 总结和展望

抗体药物迅猛发展，抗体的纯化问题日益突显，高效、低成本、高纯度地获得抗体成为最关键的步骤。现通用的蛋白A介质成本高，且不耐受苛刻条件，因此需开发经济有效的纯化方法。疏水电荷诱导层析由于其选择性较好，洗脱条件相对温和、价格低廉，而且初始样品可不经预处理直接上柱，操作简便，若大规模应用于抗体纯化，会带来很高的经济效益。另外，短肽类仿生亲和配基与生物亲和配基具有相似的亲和力，然而构象更加稳定，并且已成功应用于抗体纯化。随着计算机辅助技术及高通量筛选技术的进以及技术的推广，仿生亲和技术应用会越来越广泛，抗体的低成本、高效率生产指日可待。

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