长沙臭豆腐卤水生产工艺优化探讨

侯艳梅，贺 静，廖卢艳，石 聪，3，蒋立文，3*

（1.湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.海普诺凯营养品有限公司，湖南 长沙 410003；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

卤水发酵是长沙臭豆腐制作的关键步骤之一，一般采用竹笋、浏阳豆豉、香菇为主料，适当添加豆腐脑等进行混合发酵，混合发酵时间长达1年以上，发酵条件粗放、周期长、不标准、产品质量不稳定是限制长沙臭豆腐规模化生产发展的重要瓶颈。白豆腐放入卤水中卤制是长沙臭豆腐的主要工序，作为长沙臭豆腐的重要特点“闻起来臭，吃起来香”，卤水是臭豆腐“臭”的主要来源，滋味也与卤水成分密切相关。卤水挥发性成分是表现发酵品风格和特征性差异的重要方面之一，已经引起学者关注。大量研究发现臭豆腐卤水共性物质主要是苯酚类和吲哚类物质[1-2]。谢靓[3]对臭豆腐卤水挥发性指纹图谱进行了研究，获得了采用微固相萃取-气质联用测定臭豆腐卤水挥发性成分的最佳萃取条件和测定参数。李雨枫等[4]研究了臭豆腐卤水发酵过程中微生物变化，发现在卤水发酵过程中细菌总数数量级在108CFU/mL以上。石聪等[5]研究了在发酵成熟的卤水中加入一定数量保护剂后进行真空冷冻干燥，检测臭豆腐卤水冻干前后微生物总数的变化并比较3种臭豆腐卤水及其冻干粉复水后挥发性成分，冻干粉制备为标准化生产提供借鉴。赵国忠等[6]研究发现，臭豆腐卤水中主要细菌为漫游球菌（Vagococcus carniphilus）、沙克乳杆菌（Lactobacillussakei）、地衣芽孢杆菌（Enterococcus avium）、鸟肠球菌（Enterococcus devriesei），鸟肠球菌单独纯种发酵所得的臭豆腐样品色泽较好，香气成分也较浓郁。但目前南方臭豆腐卤水基础研究还不是很多。

考虑到传统臭豆腐卤水发酵时间太长，参与反应原料较多，为便于控制，为规模化、标准化生产奠定基础。根据已有资料报告，考虑到浏阳豆豉[7]、竹笋[8-10]、香菇[11]在发酵过程中带来的风味与臭味差别较大，因此猜测臭豆腐中臭味物质主要可能来源于豆腐发酵。本研究以某品牌不同年限两种臭豆腐卤水作对照，直接利用黄浆水加一定比例白豆腐进行控温发酵，采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）结合气质联用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）对其挥发性成分进行鉴定，研究臭豆腐卤水和臭豆腐特征性挥发成分及对其贡献的化合物，这对于臭豆腐工业化控制及品质标准化具有一定的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卤水A、B由湖南某品牌臭豆腐生产企业取样（A为发酵三年的卤水、B为发酵两年的卤水）。卤水C为泡豆腐水，主要原料为黄浆水加入30%白豆腐直接浸泡30～37℃保温发酵1个月所得。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水机：美国Millipore公司；DK-98-11A电热恒温水浴锅、101-2AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；Talboys数显型磁力加热搅拌器：上海安谱实验科技股份有限公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）（75 μm）萃取针头：美国Supelco公司；岛津GCMSQP2010型气相色谱-质谱联用仪：日本SHIMADZU（岛津）公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

固相微萃取头在每次首次使用时必须在进样口进行老化，将PDMS萃取头在300℃的条件下活化60 min，直至色谱检测无杂峰出现。称取研磨均匀的臭豆腐1.00 g放入20 mL SPME样品瓶中，加入4.00 mL超纯水摇匀，用密封垫与铝帽进行密封，密封后在70℃的条件下利用磁力搅拌器加热平衡20 min，搅拌速度为200 r/min，将已活化的萃取头通过隔垫顶空插入样品瓶内，推出纤维头，使之距样品液面约1 cm，顶空吸附40 min，在拔出萃取头前抽回纤维头，再将萃取头插入气相色谱进样口，并且推出纤维头，在240℃条件下解吸5 min。臭豆腐卤水则吸取2.00 mL放入20 mL SPME样品瓶中，用密封垫与铝帽进行密封，密封后在60℃的条件下利用磁力搅拌器加热平衡40 min，其他同上。

1.3.2 气质联用色谱条件

色谱柱为CD-WAX弹性石英毛细管柱（30cm×0.25mm×0.25 μm）；载气为高纯（纯度99.999%）氦气，氦气流速1.0 mL/min；进样口温度240℃；不分流进样。程序升温：柱温50℃，保持2 min，以5℃/min升温至200℃，保持14 min，以15℃/min升温至240℃。

质谱条件：离子源为电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度200℃；电子能量70 eV；发射电流150 μA；倍增器电压1 037 V；接口温度220℃；质量扫描范围45～500 m/z。

1.3.3 定性定量分析

总离子流色谱图经美国国家标准技术研究所（national institute of standard technology，NIST）2014s标准谱库检索定性鉴定出成分，采用面积归一法进行定量分析，得到各成分在臭豆腐卤水挥发性风味物质中的相对含量。

2 结果与分析

2.1 卤水A、卤水B及卤水C中的挥发性成分总离子流色谱图

卤水A、卤水B及卤水C中挥发性成分GC-MS分析的总离子流色谱图见图1。

图1 卤水A(a)、卤水B(b)及卤水C(c)挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components from brine A(a),brine B(b)and brine C(c)analysis by GC-MS

2.2 三种卤水中主要挥发性物质成分分析结果

卤水A、卤水B及卤水C中挥发性成分GC-MS分析结果见表1。

表1 卤水A、B及C中的主要挥发性成分GC-MS分析结果Table 1 Results of main volatile components in brine samples A,B and C analysis by GC-MS

续表

续表

2.3 三种卤水主要挥发性成分结果分析

由表1可知，在卤水A中，利用萃取头鉴定出了37种物质。其中酸类10种、酚酮类9种、醇类8种、酯类3种、烷烯类2种、萘类2种、其他类3种。从种类数量上来看，酸类、酚酮类、醇类可能是卤水A中重要的气味物质的来源；从相对含量上分析，酚酮类的相对含量为60.61%，酸类为18.24%。酸类和酚酮类，从相对含量上分析可能是卤水A的挥发性组分的重要来源。

在卤水B中，利用萃取头鉴定出了47种物质。其中萘类19种、苯类9种、烷烯类6种、醇类5种、酚酮类4种、茚类2种、其他类2种。从种类数量上来看，萘类、苯类、烷烯类可能是卤水B中重要的气味物质的来源；萘类的相对含量为61.41%，苯类为15.66%，醇类为6.56%，苯酚类和吲哚类也有一定含量，可能是卤水B的“臭味”成分的重要来源。其他种类的挥发性物质的相对含量较少，但是有有其独特的风味，可能与卤水B的风味形成至关重要。如苯乙酮具有山楂花香气，金合欢和含羞草似的香韵。甲基庚烯酮有强烈的油脂气息，持有新鲜的青香，伴有柑橘香韵。甲基壬基甲酮有油脂气息、草香香气，并带有柑橘似的香韵。

在卤水C中，利用萃取头鉴定出了48种物质。在卤水C中萃取头鉴定出萘类13种、苯类10种、烷烯类8种、酚酮类7种、醇类3种、茚类2种、酸类2种，其他类3种。从种类数量上来看，萘类、酚酮类、烷烯类可能是卤水C中重要的气味物质的来源；从相对含量上分析，萘类的相对含量为35.32%，苯类为36.42%，烷烯类为7.17%，烷烯类没有味道，苯类和萘类均有特殊气味，但其他种类的挥发性物质的相对含量较少，也可能与卤水C的风味形成至关重要。例如，异戊酸具有强烈的不愉快的气味和酸味，高度稀释后则有甜润的果香以及笃斯越桔样的香味。雪松醇有持久的柏木样的木香气息等[12-13]。

综述上面3种卤水，部分成分相对含量较低，其可能敏感气味阈值很低，如吲哚、苯酚类，感受阈值0.01 μg/kg左右，浓度较低有花香味道，稍微高些就有特殊臭味，卤水样中共有挥发性物质见表2。

表2 卤水样中共同含有的挥发性成分Table 2 Common volatile substances in brine samples

在以上的共有物质中，3-甲基吲哚是在卤水中始终含有的物质，3-甲基吲哚具有强烈的粪便臭味，稀释后有令人愉快的花香和动物型香气，并带有成熟的水果香味。卤水A、B中共有的物质有6种，α-松油醇具有松木和丁香似的香气，而柏木脑有温柔的柏木香气，香气质量取决于原料品种和提纯的程度。其中β-柏木烯具有木香气息。2-乙基-4-甲基噻唑是具有咖啡挥发性香味组分之一，有咖啡、炒榛子等坚果样香味。卤水A、C中共同物质包括5种，其中4-甲基苯酚具有“窖泥臭”，α-松油醇具有类似紫丁香的香气，稀释后具有桃的甜味；苯酚对臭豆腐的香气起到增稳定性起到了一定作用，并且具有防腐和杀菌的作用，它的存在对产品的稳定性起到了一定作用。卤水B、C中的共同物质有16种。将三种卤水的共同成分对比，得到3-甲基吲哚是具有特殊“臭味”主要成分来源，从三种卤水共有成分来说，借助经验评判结合实际测定相对含量，臭味成分基本上是类似的。

2.4 讨论

卤水中复杂的挥发性成分与原料来源发酵过程中微生物有关，而贺静[1]在臭豆腐卤水发酵过程中鉴定出挥发性成分共122种成分，核心气味物质吲哚类、苯酚类物质在卤水中始终存在，这些物质构成了是臭豆腐臭香味主体物质，其含量与卤水发酵时间密切相关。

豆腐本身的气味成分与黄豆品种及加工工艺有密切关系，大豆豆腥味一直是研究关注热点，SMOUSE T H等[14-15]早在20世纪中叶就研究过，己醛和正已醇是豆腥味主要成分。杨森等[16-19]对不同品种和不同发育时期的大豆进行分析和加工豆奶、脂肪氧化酶产物等分析挥发性成分差异较大，主要包括醛类、醇类、酮类、酯类、呋喃类、烃类、酸盐类和呋喃类等，且相互间的差异较大。KOHAYASHI A等[20-21]研究了豆类制品致腥挥发性成分基本上集中在醇类、醛类等主要成分，只是种类差异较大。而选用不用的大豆和不同的工艺测定的挥发性成分均有差异，本研究测定出的挥发性成分相对含量主要为醇类、酯类和烷烃类物质，而其重要的气味成分可能是醇类、酸类、烷烃类。

不同配料及不同发酵时间臭豆腐卤水主体气味是有很大的差异，本研究针对豆腐与卤水的气味成分的关系进行探讨，在卤水中主要的成分物质可能是其原料中的物质本身和经过发酵而产生。蒋立文等[7]指出在浏阳豆豉的特殊香气成分与愈创木酚和吡嗪有密切的关系。芮汉明等[22]用GC-MS分析香菇的挥发性成分主要是一些硫和八碳的化合物，其中二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、甲硫基二甲基三硫醚、1,2,4-三硫杂环戊烷、香菇精是香菇的特征风味成分，以含硫的杂环化合物最为重要。安晶晶等[23]用蒸馏萃取（distillationextraction，SDE）和GC-MS检测鲜香菇中八碳化合物含量为44.13%，含硫化合物含量为21.53%；1-辛烯-3-醇是鲜香菇最特征的风味物质。任旺等[8]采用GC-MS对麻竹笋中多酚类化合物检测，共鉴定出24种挥发性物质，其中含量较高的物质有乙酸、4-对羟基苯甲醛、4-对羟基苯乙睛、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4-吡喃、1,2,3,5-四羟基环己烷和丙酮醇等，而邻苯二酚和3-甲基邻苯二酚为提取物中的挥发性酚类的主要物质。

从本设计方案来看，某品牌卤水发酵时间较长，并且成分比较复杂，含有竹笋、浏阳豆豉、香菇、豆腐、黄浆水等原料各种成分以及长时间自然发酵微生物代谢产物，这些成分与产物又会发生复合作用形成多种其他物质如酯类等，而从传统卤水实际控制过程来看，在长时间发酵过程中需要不断补充豆腐这类物质作为卤水活性保持重要因素；豆腐加黄浆水混合发酵主体物质基础为大豆主要成分，发酵过程中主要微生物源自环境和原料本身带入，所以C样品中主要产物是大豆蛋白质分解产物，蛋白质含量要比A、B样品高得多，其特征代谢产物在挥发性成分指标上与对照样品差别较大，而滋味成分方面可能比前面对照样品具有更大优势，这应该是下一步需要研究主要内容之一。目前探讨主要还是集中在纯豆腐黄浆水发酵是否可以形成臭豆腐卤水中“臭”挥发性指纹图谱相似的物质，这将为卤水生产规模化生产调整提供理论参考。3结论

臭豆腐风味小吃要求的不仅是气味成分，还需要滋味成分存在才构成南方臭豆腐的特殊味道，这需要将采用滋味成分综合评价相结合才能确定，因此本研究探讨的采用纯黄浆水结合豆腐控制发酵形成臭味具有可行性，结果表明，不同来源卤水在不同发酵阶段的主体物质均不同，泡豆腐水（卤水C）和某品牌卤水（卤水A、卤水B）臭豆腐挥发性成分数量差别较大，分别有48种，37种、47种。一方面为了传统产品特色需要有老卤水存在，另外规模化生产需要大量卤水，完全依赖于老卤水无法形成产业化生产，所以研究为臭豆腐卤水简化工艺提供了可能，但是否完全可以替代传统卤水制作工艺或需要发酵工艺优化，这需要以后进一步深入研究。

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