电针对退变椎间盘AQP 1、3表达的影响*

佟思琪，邹 璟，黄国付,3**

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.湖北省武汉市第一医院，湖北 武汉 430022；3.湖北省武汉市武昌医院，湖北 武汉 430063)

腰椎间盘退变性疾病是指以椎间盘退变为病理基础的一类疾病，发病率高，且易反复发作，其不仅对患者的生活质量产生明显负面影响，严重者甚至可能导致患者丧失劳动能力，这给患者带来了生理、心理、经济等多方面的负担[1]。针灸治疗本病在临床上得到了广泛运用，临床很多研究也证实了电针治疗腰椎间盘退行性疾病的确有较好的疗效，但其治疗作用机制尚不清楚。最近研究发现，椎间盘退变与椎间盘软骨终板途径营养供应减少密切相关，其中水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)介导的水转运是椎间盘组织营养物质供应的始动途径[2]，提示椎间盘退变与AQPs密切相关。本研究拟观察电针对椎间盘退变模型兔软骨终板中AQP 1、3表达的影响，进而探讨电针防治本病的可能机制。

1 材 料

①实验器材：椎间盘施压器；电钻；Signa HDx3.0T磁共振器；实验兔固定器；HANS电针仪；CX 41倒置显微镜。②主要试剂：甲醛溶液、二甲苯、无水乙醇、3 %H2O2、抗荧光衰减封片剂、rabbit AQP 1抗体(abcam)、rabbit AQP 3抗体(abcam)等。③实验动物：由武汉大学实验动物中心(合格证编号NO：42000500005757等)提供的年龄约5个～6个月的健康的骨骼发育成熟的雄性新西兰大白兔50只，体重3.0 kg～4.0 kg。在实验室标准条件下适应性饲养3周后再开始实验。

2 治疗方法

①造模方法：参照Kroeber M[3]及黄国付等的造模方法，用10 %水合氯醛(1 mL/kg)在兔耳缘静脉注射麻醉。备皮后，分别在相邻椎体(L4、L5)一侧的椎旁约1.5 cm处做约1 cm垂直切口，钝性分离肌肉，暴露椎体后，用克氏针(直径1.5 mm)垂直刺入两椎体间，并用电钻将克氏针横穿透椎体及对侧皮肤，缝合切口。最后将自制的弹簧装置安装于克氏针两端，持续施压200 N，并维持28 d。术后常规肌肉注射青霉素预防伤口感染，4×106 U，1次/d，持续5 d。在造模第28天拆除加压装置后予以磁共振检测，以评估造模成功与否。②分组：将50只兔进行编号，查随机数字表均分为5个小组。正常组：自然条件下饲养，不予干预。模型组：造模成功后，不予干预。假模型组：同模型组，但在造模过程中只是安装了自制弹簧装置，而不施压。模型+电针组：在造模成功后第1天起每日行电针治疗1次，1个疗程为6 d，每个疗程之间休息1 d，治疗共4个疗程。模型+电针+HgCl2组：于造模成功后第1天皮下注射AQPs抑制剂0.1 mMHgCl20.05 mL，治疗同电针组。③电针治疗：将兔固定在支架上，参考《实验针灸学》[4]中“实验动物穴位标准定位”，选取兔L4、L5两侧夹脊穴，用28号长1寸的毫针快速捻转进针，直刺0.5 cm～0.8 cm，待针下有沉涩感后，在脊柱两侧分别接一组电极(HANS电针仪)，刺激参数调整为：调频波(2/15 Hz)，1 mA～2 mA，20 min。

3 疗效分析

3.1 评定标准

在造模后第1天和第28天两个时间点，各组分别取5只行L4～L5椎间盘MRI矢状位(T 2加权)平扫，以观察椎间盘信号变化，进而来判断造模是否成功。然后处死实验兔，取椎间盘组织，供免疫荧光技术检测兔腰椎间盘组织中AQP 1、3的表达情况。免疫荧光技术操作方法：切片脱蜡-抗原修复—孵育—加荧光一抗—加荧光二抗—封片—采集图片。观察每张切片在显微镜高倍镜下放大400倍后不同时间点的视野成像，对阳性细胞数目进行记录，并计算AQP 1、3阳性细胞相对光密度值。

3.2 统计学方法

3.3 治疗结果

3.3.1 MRI检查结果

图1 五组椎间盘模型兔造模后第28天椎间盘MRI比较

正常组与假模型组实验兔的各椎间盘表现为均匀明亮的正常高信号，而其余三组实验兔造模后椎间盘信号较相邻正常椎间盘信号均有不同程度的降低，有的甚至呈“黑间盘”表现。由此可见，造模成功；且模型组与造模+电针组相比，电针治疗后的椎间盘信号较模型组增强，可见电针治疗能促进兔退变椎间盘修复。见图1。

3.3.2 免疫荧光技术检测结果

造模成功后第1天，模型组、模型+电针组及模型+电针+HgCl2组三组之间差异无统计学意义(P>0.05)，且较正常组，三组AQP 1、3表达水平均明显降低，差异有统计学意义(与正常组第1天相比，P<0.05)；模型组第28天的AQP 1、3表达水平较第1天升高，差异无统计学意义(与模型组第1天相比，P>0.05)；模型+电针组第28天的AQP 1、3表达水平较第1天升高，差异有统计学意义(与模型+电针组第1天相比，P<0.05)；模型+电针+HgCl2组第28天的AQP 1、3表达水平较第1天之间的差异无统计学意义(与模型+电针+HgCl2组第1天相比，P>0.05)。见图2，图3。

图2 各组第28天AQP 1免疫荧光图结果

图3 各组第28天AQP 3免疫荧光图结果

4 讨 论

椎间盘退变是指椎间盘自然老化、退化的生理病理过程，严重的腰椎退行性病变可以引起腰腿痛甚至神经损害，影响工作能力和生活质量。统计表明[5]，约2/3世界人口在其一生当中经历不同程度的腰痛。目前，针对椎间盘退变引起腰痛临床治疗方法主要包括药物、物理康复及手术治疗[6]。药物治疗仅仅只能缓解疼痛症状，治标不治本，治愈率低，复发率高。手术治疗创伤大，费用高，而且一方面内固定限制了脊柱的活动度，另一方面又可能会加速邻近节段椎间盘的退变。物理康复治疗是目前临床上最主要的方法[7]，其中，针刺作为中医传统特色疗法得到了临床上的广泛运用，其不仅操作简单易行、医疗费用经济、副作用少，且大量的基础及临床研究也证实了针刺对于防治本病疗效显著。

椎间盘细胞与机体其他组织一样，为了维持细胞功能正常代谢需要充足的营养物质供应，而成熟的椎间盘需要从软骨终板渗透中获得营养供应[8]。研究发现[9]，椎间盘营养物质的渗透率与纤维环及软骨终板的水化程度呈正相关。AQP 1、3在软骨终板、纤维环及髓核细胞都有表达，且在软骨终板的中心表达最强，此外其特殊的空间分布特点对椎间盘的水的进出有显著的影响。因此，AQP 1、3的表达下降会改变软骨终板和纤维环对水的通透性，导致椎间盘含水量减少，进而必然会影响营养物质的吸收。由此可见，如何调控终板软骨细胞AQPs的表达，增加以水为主的营养供应，是治疗椎间盘退变性疾病的重点。

Kroeber M等[3]通过对椎间盘的高度、组织形态学、细胞存活、生物力学等多方面的研究，认为轴位动力牵引可使退变的兔椎间盘组织再生。由此可见，退变的椎间盘在组织学上的变化是可逆的[10]。根据《内经》“治未病”的原则，延缓、阻止甚至逆转椎间盘退变，应当是防治椎间盘退变性疾病的首要措施。在治未病方面，祖国传统医学有着独特的优势，其中针灸疗法在临床上一直备受医生及患者的广泛青睐。因此，采用针灸疗法延缓、阻止甚至逆转腰椎间盘退变继发各种病症显得格外有潜力。

本实验参照国外研究者Kroeber等[3]的造模方法，在相邻的椎体间进行短期动态加压，通过刺激椎间盘基质降解与合成的失衡从而诱发椎间盘退变。实验结果提示，退变的椎间盘软骨终板细胞中AQP 1、3的表达明显下降；电针可上调退变椎间盘终板软骨细胞中AQP 1、3的表达水平；电针夹脊穴可延缓椎间盘退变，并促进退变椎间盘组织的修复。这一实验结果揭示了电针夹脊穴可上调终板软骨细胞AQP 1、3的表达水平，增加软骨终板途径以水为主的营养供应，进而达到控制椎间盘退变的始动因素，延缓椎间盘退变，并促进退变椎间盘组织的修复，为临床应用电针防治腰椎间盘退行性疾病提供一定的科学的实验依据。但是，电针具体是通过何种途径调控AQP 1、3的表达，以达到治疗椎间盘退变性疾病的目的，有待我们进一步探讨研究，为临床针灸提供更为坚实的科学理论依据。

参考文献：

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[2] Conner M T,Conner A C,Brown J E,et al.Membrane trafficking of aquaporin 1 is mediated by protein kinase C via microtubules and regulated by tonicity[J].Biochemistry,2010,49(5):821-823.

[3] Kroeber M, Unglaub F, Guegring T, et al. Effects of controlled dynamic disc distraction on degenerated intervertebral discs: an in vivo study on the rabbit lumbar spine model[J]. Spine, 2005,30(2):181-187.

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[5] Deyo R A, Weinstein J N. Low back pain [J]. N Engl J Med,2001, 344(5):363-370.

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[7] 张延松，胡侦明，郝 杰.椎间盘退变基因治疗进展[J].中国矫形外科杂志，2014,22(7)：617-619.

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[9] 曹国永，周 跃，滕海军，等.水通道蛋白在正常大鼠椎间盘组织中的表达与分布[J].中国矫形外科杂志，2005，13：996-999.

[10] Guehring T,Omlor G W,Lorenz H,et al.Disc distraction shows evidence of regenerative potential in degenerated intervertebral discs as evaluated by protein expression, magnetic resonance imaging, and messenger ribonucleic acid expression analysis[J].Spine,2006,31(15):1658-1665.