血清MMP-13和TIMP- 2在骨肉瘤转移中的临床意义

崔涛，孙立山，王贵江，王丽国

沧州市中心医院骨科，河北 沧州061001

骨肉瘤是临床上比较常见的恶性肿瘤，占原发性骨肿瘤的10%，大多数患者的发病年龄为10～30岁，严重影响了患者的身心健康[1]。骨肉瘤以产生类骨样梭形细胞为主要特征，易发生血行转移，严重时可导致患者死亡。Harbert等[2]研究发现，80%的骨肉瘤患者在确诊时发生肺转移，25%的患者在尸检时发生骨转移。另有研究发现，骨肉瘤发病后若不治疗，患者的生存时间仅有18～24个月，因此早诊断、早治疗是改善患者预后的关键[3]。基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）为基质金属蛋白酶家族的重要成员，在多种恶性肿瘤的侵袭与转移中扮演着重要角色；基质金属蛋白酶组织抑制物-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）表达水平的高低与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关，对MMP-13和TIMP-2的表达水平进行测定将有助于预测骨肉瘤是否发生转移。本研究通过检测MMP-13和TIMP-2在骨肉瘤标本中的表达，探讨骨肉瘤转移与MMP-13和TIMP-2的关系，旨在为骨肉瘤转移的预测提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取沧州市中心医院病理科存档的52例骨肉瘤患者的标本，其中男34例，女18例；年龄9～48岁；部位：肱骨8例，桡骨2例，髂骨1例，股骨23例，胫骨12例，腓骨6例；发生转移11例，未发生转移41例。所有患者均行手术治疗，术前均未行放疗及化疗，每个标本均经临床、病理及放射学检查确诊。组织学分型：骨母细胞型20例，其中男13例，女7例，平均年龄（19.12±12.23）岁；纤维母细胞型12例，其中男8例，女4例，平均年龄（22.38±9.48）岁；软骨母细胞型9例，其中男6例，女3例，平均年龄（23.34±7.69）岁；血管扩张型6例，其中男4例，女2例，平均年龄（21.47±6.67）岁；小细胞型5例，其中男3例，女2例，平均年龄（24.43±5.05）岁。不同组织学分型骨肉瘤患者的年龄和性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组织化学染色及评价标准

1.2.1 免疫组织化学法 将干净的玻片上涂抹APES防脱片胶，捞取组织切片并标注病历编号，于60℃恒温箱中放置1.5 h，使组织与玻片紧密黏附。采用链霉亲和素-过氧化物酶复合物法进行染色，实验组加入MMP-13或TIMP-2一抗，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，滴加生物素标记的二抗，PBS清洗3次，二氨基联苯胺（DAB）染色10～15 min，蒸馏水洗涤，树胶封片，采用显微镜进行观察。实验中阳性对照组采用胰腺癌标本，结果为阳性；阴性对照组用正常血清代替一抗，结果为阴性；空白对照组用PBS代替一抗，结果为阴性。

1.2.2 MMP-13阳性判断标准 镜下观察可见棕黄色颗粒判断为阳性。每张玻片在高倍镜下取10个视野，阳性细胞所占百分比＞60%，染色较深，判断为强阳性（++）；阳性细胞所占百分比为10%～60%，染色一般，判断为弱阳性（+）；阳性细胞所占百分比＜10%，判断为阴性（－）。

1.2.3 TIMP- 2阳性判断标准50%以上肿瘤细胞染色为强阳性（++）；26%～50%肿瘤细胞染色为弱阳性（+），26%以下肿瘤细胞染色为阴性（－）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对-数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用F检验；计数资料以例数或率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-13和TIMP- 2在不同组织学分型骨肉瘤标本中的表达情况

在各种组织学分型的骨肉瘤标本中均可见到MMP-13有不同程度的表达，其阳性表达率为77.8%～83.3%；而TIMP-2的阳性表达率较低，为30.0%～40.0%。不同组织学分型骨肉瘤患者的MMP-13和TIMP-2阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 MMP-13和TIMP- 2在不同组织学分型骨肉瘤标本中的表达情况[ n（%）]

2.2 MMP-13和TIMP- 2在不同性别骨肉瘤患者中的表达情况

MMP-13在男性和女性骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为79.4%和77.8%，差异无统计学意义（P＞0.05）；TIMP-2在男性和女性骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为32.4%和27.8%，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 MMP-13和TIMP- 2在不同性别骨肉瘤患者中的表达情况[ n（%）]

2.3 MMP-13和TIMP- 2在不同部位骨肉瘤患者中的表达情况

MMP-13在上肢、下肢和其他部位骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为80.0%、78.0%和100%，差异无统计学意义（P＞0.05）；TIMP-2在上肢、下肢和其他部位骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为30.0%、31.7%和0，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 MMP-13和TIMP- 2在不同部位骨肉瘤患者中的表达情况[ n（%）]

2.4 MMP-13和TIMP- 2在有转移和无转移的骨肉瘤患者中的表达情况

MMP-13在有转移和无转移的骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为100%和34.1%，差异有统计学意义（χ2=4.318，P=0.038）；TIMP-2在有转移和无转移的骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为9.1%和61.0%，差异有统计学意义（χ2=3.989，P=0.046）。（表4）

表4 MMP-13和TIMP- 2在有转移和无转移的骨肉瘤患者中的表达情况[ n（%）]

3 讨论

骨肉瘤转移与多种因素有关，是一个不断发展的过程。有学者提出，肿瘤转移共分为3个步骤：吸附、溶解和移行[4]。肿瘤细胞的转移与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）密切相关，因为肿瘤细胞能产生一种蛋白酶降解ECM。研究表明，一些肿瘤细胞亚群对于肿瘤细胞的转移起到至关重要的作用[5-6]，有些转移能力较强的肿瘤细胞能够分泌MMP-13和TIMP-2[7-8]。说明MMP-13和TIMP-2在调节ECM过程中发挥重要作用。

研究证明，MMP-13在正常组织中无表达[9]，在肿瘤组织中的表达水平相对较高[10]。Ohtani等[11]研究发现，在肿瘤细胞的细胞质中可见少量的MMP-13颗粒，说明肿瘤细胞可能具有吸附MMP-13的能力。目前研究发现TIMP-2在多种肿瘤组织中均有表达[12]。吴登龙等[13]研究发现，TIMP-2在肾癌组织中的表达水平明显低于正常肾组织。魏群等[14]在对大肠癌的研究中发现，TIMP-2在正常组织与肿瘤组织中的表达比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究结果表明，在各种组织学分型的骨肉瘤标本中均可见到MMP-13有不同程度的表达，其阳性表达率为77.8%～83.3%；而TIMP-2的阳性表达率较低，为30.0%～40.0%。MMP-13和TIMP-2的表达情况与骨肉瘤患者的性别无关（P＞0.05）。以往研究证实，MMP在自然界中广泛存在，多数分布在植物及无脊椎动物中，几乎可以降解ECM的所有成分，MMP也是迄今人类发现的能够分解纤维类胶原的唯一酶类[15]。MMP家族可分为5大类共20多种，其中MMP-13对于降解ECM有其独特的作用[16-18]。在正常组织中，MMP-13无表达或很少表达，而在炎性因子、激素及其他因素的刺激下，其表达水平剧增，这与人体生理病理过程如炎性反应、胚胎发育或肿瘤转移有关[19]。TIMP是近年来发现的具有抑制MMP活性的一组多功能因子家族。TIMP家族成员根据发现的先后顺序分别命名为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP-2作为MMP-2特异性的抑制剂，在控制肿瘤播散转移、组织的修复与重塑过程中发挥着重要作用；但对生长的影响，既有直接的生长促进活性，又有生长抑制作用，这可能是由于细胞类型不同所致。本研究结果发现，MMP-13在有转移和无转移骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为100%和34.1%，TIMP-2在有转移和无转移骨肉瘤患者中的阳性表达率分别为9.1%和61.0%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示MMP-13和TIMP-2与骨肉瘤的转移有关。综上所述，MMP-13和TIMP-2与骨肉瘤的转移有关，可作为判断骨肉瘤转移的指标。

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