siRNA干扰Gadd45α表达对皮肤鳞状细胞癌A431细胞侵袭和迁移的影响

李小静 李志锋 韩昭 燕霞 李显平 刘保国 刘志军056002河北邯郸，河北工程大学附属医院皮肤科

皮肤鳞状细胞癌（简称鳞癌）组织中生长抑制和DNA损伤诱导45蛋白α（growth arrest and DNA damage inducible 45α，Gadd45α）表达升高，且高分化组织中表达高于低分化癌组织，推测Gadd45α异常表达可能参与鳞癌发病过程［1］。为进一步探讨Gadd45α在皮肤鳞癌中参与肿瘤侵袭转移的作用，我们利用小RNA干扰技术下调皮肤鳞癌细胞株A431细胞Gadd45α基因表达，从而观察Gadd45α对A431细胞侵袭和迁移等生物学行为的影响。

一、材料与方法

1.Trizol、G418产自美国Invitrogen公司，A431、Colon16细胞产自美国标准生物品收藏中心（ATCC），兔抗人Gadd45α多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，实时荧光定量PCR试剂盒产自美国Promega公司，CytoSelect 24孔细胞移行试验试剂盒为美国Cell Biolabs公司产品，Transwell小室为美国Corning公司产品。

2.细胞培养及转染：皮肤鳞癌细胞株A431细胞、Colon16细胞均采用含10%胎牛血清的Dulbecco极限必需培养基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM），培养条件为37℃、5%CO2。选择对数生长期细胞接种于24孔板，按照Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒说明书转染操作。细胞转染后继续孵育48 h后接种于培养瓶。利用1 000 mg/L G418筛选2周。将筛选的细胞接种形成克隆，在尚未发生融合时，荧光显微镜下用刮刀挑取克隆，继续培养于含G418（500 mg/L）的培养基中。

3.引物设计：在基因库中查找Gadd45α基因序列，用Primer zpremier5.0软件设计引物，使用核酸序列数据库检索程序排除其他的可能同源序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′⁃GCGTCCAACAATGA GACCTACTG⁃3′，下游引物：5′⁃GGCAAAGCCCAAGACAACG GAGA⁃3′，目的产物302 bp。

4.siRNA序列设计：用美国Ambion公司和德国Qiagen公司的siRNA设计软件设计4条siRNA序列（表1），由南京金斯特公司合成双链siRNA编码序列。将A431细胞随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组：实验组转染Gadd45α⁃siRNA，阴性对照组转染阴性对照siRNA，空白对照组不做任何处理。

5.实时荧光定量PCR检测A431细胞、Colon16细胞及A431细胞转染后Gadd45α mRNA的表达水平：应用Trizol试剂提取各细胞总RNA，测定总RNA质量和浓度，A260/A280比值在1.9～2.1之间为合格，各样本取大致等量的总RNA，按说明书推荐条件将其反转录为cDNA，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：95℃预变性2 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次，最后72℃再延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定凝胶紫外线成像仪下观察、拍照，检验各电泳条带的灰度值，计算Gadd45α与β肌动蛋白灰度比值。所有实验均重复3次。

6.Western印迹检测A431、Colon16细胞株及A431细胞转染后Gadd45α蛋白表达：分别提取各细胞总蛋白，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞后，加入预冷的蛋白裂解液，收集上清液，提取细胞总蛋白，Brodford法测定蛋白含量。取70 μg蛋白上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）垂直电泳、聚亚乙烯双氧化物（PVDF）转膜，加入一抗（兔抗人Gadd45α抗体）、二抗（辣根过氧化物酶羊抗兔抗体，1∶5 000），X线曝光、显影及定影，用各抗体灰度值与3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）灰度值的比值代表各目的蛋白的相对表达量。所有内参均使用β肌动蛋白。每组样本各重复实验3次。

7.Transwell实验测定转染对A431细胞侵袭能力的影响：先在每个Transwell小室的多聚碳酸酯膜上铺人工基底膜胶（Matrigel），制成人工基底膜。分别取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后，以无血清培养基调整浓度为0.6×106/ml，将Transwell小室置入24孔板中，加入无血清培养基，室温放置2 h，在小室外部加入含10%血清的培养基500 μl，弃去小室内部的无血清培养基，加入300μl细胞悬液，孵育48 h后，将小室置入含500 μl染液的培养孔中染色20 min，干燥后显微镜下计数高倍（×200）视野下穿过小室的细胞数。每组实验重复3次。

8.细胞划痕法测定转染前后细胞的迁移能力：制备转染前后A431单层细胞，用10 μl移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS清洗3次，孵育24 h后换成含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液孵育24 h，吸去培养液，用PBS清洗3次，高倍镜下计数迁移到划痕区的细胞数目。实验重复3次。

9.统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据用以±s表示，作方差齐性检验，采用方差分析统计数据，组间比较采用LSD⁃T检测，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 针对Gadd45α基因的转染序列

二、结果

1.Gadd45α在两种皮肤鳞癌细胞株中的表达：Gadd45α基因在A431和Colon16细胞中均有表达，表达水平分别为0.985±0.017和0.480±0.016；Gadd45α蛋白在2株细胞中均有表达（图1），表达水平分别为0.433±0.035和0.070±0.021。因此后续研究选取高表达Gadd45α基因和蛋白的A431细胞。

2.siRNA抑制Gadd45α mRNA的表达：实时PCR显示，阴性对照组Gadd45α mRNA表达水平为1.028±0.183，空白对照组为1.001±0.057，实验组siRNA⁃1干扰组表达水平为0.286± 0.013，siRNA⁃2干扰组为0.553±0.042，siRNA⁃3干扰组为0.484±0.027，siRNA⁃4干扰组为0.683± 0.015，siRNA⁃1干扰效果最好，故作为实验组。统计学分析显示，实验组、阴性对照组、空白对照组间差异有统计学意义（F=5 893.857，P＜0.001），实验组与阴性对照组和空白对照组间差异均有统计学意义（P=0.001）。

3.siRNA抑制Gadd45α蛋白的表达：Western印迹检测显示，实验组条带明显变窄（0.33±0.007），与阴性对照组和空白对照组（0.87±0.002、0.86±0.004）比较，3组间差异有统计学意义（F=2 763.000，P＜0.001）；组间比较显示，实验组与阴性对照组和空白对照组间差异均有统计学意义（P=0.001）。见图2。

4.A431细胞体外侵袭能力的变化：Transwell小室实验显示（图3），培养48 h后，每高倍视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数实验组为66.33±3.79，阴性对照组为26.00±4.36，空白对照组为28.33±4.16，3组间差异有统计学意义（F=20.084，P=0.002）；组间两两比较显示，实验组与阴性对照组和空白对照组间差异均有统计学意义（P值分别为0.001、0.002）。

图1 皮肤鳞癌细胞株A431和Colon16细胞Gadd45α蛋白表达

图2 免疫印迹法检测siRNA干扰后A431细胞Gadd45α蛋白表达

图3 Transwell小室实验及细胞划痕实验检测siRNA干扰后A431细胞侵袭和迁移能力

5.细胞划痕损伤实验：单层细胞划痕24 h后，实验组细胞迁移数为315.33±6.66，阴性对照组154.67±2.08，空白对照组130.67±3.51，3组间差异有统计学意义（F=1676.255，P＜0.001）；组间比较显示，实验组与阴性对照组和空白对照组间差异均有统计学意义（P值为0.001）。见图3。

三、讨论

Gadd45在肿瘤细胞中参与多种细胞信号通路的调控，其表达缺失与肿瘤形成及进展密切相关。Gadd45α是Gadd45家族新近发现的一类细胞功能调节基因，参与多种恶性肿瘤细胞侵袭过程的调节［2］，该基因最早在紫外线照射和甲磺酸甲酯处理的仓鼠卵巢细胞中被发现，随后研究认为，放射线、氧化应激、无血清饥饿等损伤因素会增加Gadd45α的表达［3］。Gadd45α基因在乳腺癌、非小细胞肺癌组织中的表达水平较正常组织中的表达均下调，并且在前列腺癌中也发现其表达被抑制［4⁃7］。Gadd45α基因在恶性涎腺肿瘤中低表达可能诱导肿瘤细胞的恶性增殖［8］。因此认为，Gadd45α是一个肿瘤抑制因子，在多种恶性肿瘤中呈低表达的趋势，过表达该基因能够抑制癌细胞的迁移与侵袭［9］。

为了明确Gadd45α基因表达异常是否通过影响鳞癌细胞的侵袭过程来参与皮肤鳞癌的恶性生物学行为，我们利用高表达Gadd45α的A431细胞株作为研究对象，通过转染siRNA的方式来下调Gadd45α基因的表达，进而检测细胞的侵袭和迁移能力。转染Gadd45α siRNA后，A431细胞株中Gadd45α蛋白含量和mRNA含量均显著降低，说明转染siRNA能够有效降低Gadd45α的表达。进一步采用Transwell小室和细胞迁移实验检测转染A431细胞侵袭和迁移能力的变化。结果显示，干扰Gadd45α表达后，A431细胞侵袭能力明显增强。说明Gadd45α在皮肤鳞癌中可能起到抑制肿瘤侵袭的作用。

综上，皮肤鳞癌A431细胞株高表达Gadd45α基因与蛋白水平，下调A431细胞Gadd45α表达能够促进癌细胞侵袭与迁移，但Gadd45α对皮肤鳞癌的抑制作用机制尚需进一步研究。

［1］李小静,王震英,刘毅,等.p53、Gadd45α蛋白在皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌中的表达［J］.中国麻风皮肤病杂志,2011,27（7）:455⁃457.doi:10.3969/j.issn.1009⁃1157.2011.07.003.

［2］Zhang L,Yang Z,Liu Y.GADD45 proteins:roles in cellular senescence and tumor development［J］.Exp Biol Med（Maywood）,2014,239（7）:773⁃778.doi:10.1177/1535370214531879.

［3］Moskalev A,Plyusnina E,Shaposhnikov M,et al.The role of D⁃GADD45 in oxidative,thermal and genotoxic stress resistance［J］.Cell Cycle,2012,11（22）:4222⁃4241.doi:10.4161/cc.22545.

［4］Tront JS,Willis A,Huang Y,et al.Gadd45a levels in human breast cancer are hormone receptor dependent［J］.J Transl Med,2013,11:131.doi:10.1186/1479⁃5876⁃11⁃131.

［5］Higashi H,Vallböhmer D,Warnecke⁃Eberz U,et al.Down ⁃regulation of Gadd45 expression is associated with tumor differen⁃tiation in non⁃small cell lung cancer［J］.Anticancer Res,2006,26（3A）:2143⁃2147.

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［7］Tamura RE,Paccez JD,Duncan KC,et al.GADD45α and γ interaction with CDK11p58 regulates SPDEF protein stability and SPDEF⁃mediated effects on cancer cell migration［J］.Oncotarget,2016,7（12）:13865⁃13879.doi:10.18632/oncotarget.7355.

［8］郭淑荣,董刚,李涛,等.生长抑制和DNA损伤基因45α在人不同组织类型涎腺肿瘤中的表达［J］.医学分子生物学杂志,2015,（1）:7⁃11.doi:10.3870/j.issn.1672⁃8009.2015.01.002.

［9］Tamura RE,de Vasconcellos JF,Sarkar D,et al.GADD45 proteins:central players in tumorigenesis［J］.Curr Mol Med,2012,12（5）:634⁃651.