脂溢性角化病皮损组织蛋白酶L2表达及活性对黑素小体降解的影响

苏梦云 雷铁池 易文娟 苗芳 江珊 徐世正430060武汉大学人民医院皮肤科

脂溢性角化病（seborrheic keratosis，SK）的主要病理改变为角化过度、棘层肥厚、乳头瘤样增生，同时伴有大量黑素颗粒堆积［1⁃2］。组织蛋白酶L2（cathepsin L2，CTSL2）是一种内吞体-溶酶体木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白内切酶，表达于巨噬细胞、胸腺、睾丸、角膜上皮和表皮［3］。有人提出角质形成细胞（KC）表达CTSL2水平下降，可能减弱了对KC分泌的表皮生长因子（EGF）水解，增强了EGF介导的KC增殖［4］。研究表明，浅肤色高加索人表皮CTSL2 mRNA表达水平是深肤色非洲裔人的7.5倍［5］。超微结构观察证实，高加索人表皮KC内的黑素小体完全降解消失，而非洲裔人表皮KC内仍残留有未被降解的黑素小体［6］提示CTSL2 mRNA表达水平可能还影响着表皮内黑素小体的降解速率。本研究观察了SK皮损CTSL2的表达水平以及黑素小体超微结构变化，探讨CTSL2在SK皮损形成中的作用。

材料与方法

一、对象

2016年1-8月武汉大学人民医院皮肤科门诊确诊的SK患者20例，其中男11例，女9例，年龄57～78岁。15例（男9例，女6例）的标本石蜡包埋、制备电镜超薄切片；5例新鲜标本（男2例，女3例）分离表皮组织行PCR与酶活性测定。本研究通过武汉大学人民医院医学伦理委员会批准，入选病例均签署知情同意书。

二、试剂与仪器

Trizol试剂、RT⁃PCR试剂盒（美国Invitrogen公司）；LTSL2荧光底物 Z⁃Leu⁃Arg⁃AMC（瑞士 Enzo Life Sciences公司）；兔抗人单克隆Ki67抗体（美国Abcam公司）；AEC试剂盒（美国BOSTER公司），BCA试剂盒（美国Peirce公司），中性分散酶（美国Sigma公司），7000FA型100千伏生物型透射电镜（日本日立公司），BioTek荧光酶标仪（美国Synergy HT公司）。其余化学试剂均为市售分析纯。

三、方法

1.标本采集：取15例皮损组织与周围正常皮肤组织（对照），中性甲醛与戊二醛固定，制备石蜡切片与电镜超薄切片。取5例SK皮损与周围正常组织，用0.25%中性分散酶消化过夜，分离表皮，微量电动组织匀浆器研磨，用于总RNA提取。

2.免疫组化：石蜡切片脱蜡脱水，于三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris⁃EDTA）缓冲液（0.01 mol/L，pH9.0）中高温热修复3 min，室温自然冷却，滴加抗Ki67抗体，4℃湿盒过夜，滴加二抗孵育，AEC显色（阳性着色呈红色）；苏木素复染细胞核，中性树胶封片。

3.Fontana⁃Masson嗜银染色：石蜡切片脱蜡后，于氨银溶液中37℃避光水浴浸染2.5 h，蒸馏水洗2 min，0.1%的氯化金溶液处理3 min，蒸馏水洗2次，5%硫代硫酸钠溶液固定2 min，蒸馏水冲洗3 mim，伊红复染，无水乙醇脱水，中性树胶封片。于正置显微镜下观察并摄像，使用Image⁃J图像分析软件（美国NIH免费版）计算相同面积内黑素颗粒的灰度值。

4.透射电镜观察皮损中黑素小体外膜结构的完整性：每个标本切10张超薄切片，经铀-铅双染色后观察。

5.RT⁃PCR检测CTSL2 mRNA的表达：Trizol法提取皮肤标本中总RNA，逆转录合成第1链cDNA。引物序列：人CTSL2，正向引物5′⁃TTCCGTGAGCCT CTGTTTCT⁃3′，反向引物 5′⁃CGAATTTGCTCCTTCA AAGC⁃3′，扩增片段长度558 bp；内参照物β肌动蛋白，正向引物 5′⁃AGCGAGCATCCCCCAAAGTT⁃3′，反向引物 5′⁃GGGCACGAAGGCTCATCATT⁃3′，扩增片段长度285 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系为20 μl，反应条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环。重复3次。PCR终产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统进行灰度值扫描，并以Image⁃J软件分析，以目的条带与β肌动蛋白条带的比值代表目的基因mRNA相对水平。

6.CTSL2酶活性测定：参照文献［7］的方法。将5例新鲜的表皮片置于液氮20 s快速冷冻、复苏，连续5次，置于离心管内，电动匀浆器研磨1 min；用醋酸盐缓冲液（含100 mmol/L醋酸钠，2.5 mmol/L EDTA和2.5 mmol/L二硫苏糖醇，pH 6.0）重悬，离心取上清液。BCA试剂盒测定上清液蛋白浓度。将上清液与荧光底物于37℃孵育15 min，BioTek荧光酶标仪测定荧光强度值（激发波长365 nm，散发波长450 nm）。

7.人眼黑素小体分离与体外处理：经知情同意获取1例35岁男性行眼球摘除术患者的1枚废弃眼球。参照文献［8］用蔗糖梯度离心法分离纯化视网膜色素上皮黑素小体。将黑素小体用含有SK皮损或正常皮肤组织裂解物上清液的醋酸盐缓冲液重悬，37℃孵育1 h，离心弃上清液。黑素小体离心团块用2.5%戊二醛固定液固定，制备超薄切片，透射电镜观察。每个样本摄5张不同视野照片，计数100个黑素小体中膜不完整黑素小体的个数，计算黑素小体损伤百分率。

8.统计学分析：用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示。两组间均数比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、SK皮损组织病理检查

HE染色示，SK皮损角化过度、棘层肥厚、乳头瘤样增生。Fontana⁃Masson嗜银染色示，15例SK（棘层肥厚型13例，腺样型2例）皮损均可见大量嗜银黑素颗粒沉积，而正常皮肤仅基底层见线形沉积的黑素颗粒。SK皮损中黑素颗粒的含量高于正常皮肤（表1）。免疫组化染色示，大量Ki67阳性细胞主要分布在基底浅层，而正常皮肤仅在基底层，且SK皮损中Ki67表达量明显高于正常皮肤（P＜0.05）（表1、图1）。透射电镜结果示，SK皮损表皮细胞内黑素小体损伤率低于周围正常皮肤（P＜0.05）（表1、图2）。

表1 脂溢性角化病（SK）与周围正常皮肤组织黑素颗粒含量、黑素小体损伤率、Ki67染色、组织蛋白酶L2 mRNA表达水平及酶活性的比较（±s）

表1 脂溢性角化病（SK）与周围正常皮肤组织黑素颗粒含量、黑素小体损伤率、Ki67染色、组织蛋白酶L2 mRNA表达水平及酶活性的比较（±s）

注：RFU，相对荧光单位

组别SK皮损正常组织t值P值黑素颗粒灰度值（15例）158.43±11.79 122.43±13.95 7.63＜0.05黑素小体损伤率（%）（15例）24.33±3.06 49.00±4.00 8.49＜0.05 Ki67染色（×103）（15例）11.74±0.12 2.35±0.17 29.95＜0.05组织蛋白酶L2（5例）mRNA 0.35±0.09 0.43±0.08 3.17＜0.05酶活性（RFU，×103）17.46±0.45 28.78±0.58 34.29＜0.05

图1 正常皮肤和脂溢性角化病（SK）皮损组织染色的镜下表现 SK皮损可见角化过度、棘层肥厚、乳头瘤样增生等病理改变（HE×200），并可见大量黑素颗粒堆积（黑色箭头示，Fontana⁃Masson嗜银染色×200）；棘层中Ki67阳性细胞数量明显增加免疫组化染色（AEC显色 × 400）

二、SK皮损组织中CTSL2的表达水平与酶活性

5例SK皮损CTSL2 mRNA表达水平（图3）和酶活性（表1）低于周围正常皮肤（P＜0.05）。

三、SK皮损组织裂解物对黑素小体膜结构的影响

SK皮损裂解物处理的黑素小体破损率为32.33%±4.93%，正常皮肤为43.00%±2.65%，两组比较，n=5，t=3.30，P＜ 0.05（图4）。

图2 正常皮肤和脂溢性角化病（SK）皮损组织中黑素小体透射电镜观察（×10 000） 2A：正常皮肤组织可见破碎黑素小体（白色箭头示）；2B：SK皮损组织中可见包膜完整的黑素小体；2C、2D：分别是2A和2B图中红色方框区域的4.5倍放大图像

图3 RT⁃PCR检测脂溢性角化病（SK）皮损与周围正常皮肤组织蛋白酶L2（CTSL2）mRNA表达 M：标准参照物；1：正常皮肤；2：SK皮损

图4 透射电镜观察皮肤组织裂解物对人眼黑素小体影响（×9 600） 4A：单纯表皮裂解物；4B：正常皮肤裂解物与黑素小体共培养，红箭头处为外膜损伤的黑素小体；4C：脂溢性角化病皮损组织裂解物与黑素小体共培养。Lf：脂褐素（lipofuscin）

讨 论

通常携带癌基因突变的肿瘤细胞采用启动细胞衰老机制来抑制恶性转化［9⁃10］。而外显子或全基因组测序技术发现，SK存在多个癌基因突变，细胞衰老启动障碍和KC终末分化延缓［11］。本研究用免疫组化和透射电镜技术对比分析了15例SK皮损与周围正常皮肤组织标本，结果发现，15例SK皮损标本均可见角化过度、棘层肥厚、乳头瘤样增生，存在大量黑素颗粒堆积，KC内存在大量外膜结构完整的黑素小体，Ki67阳性细胞分布在SK皮损的基底层与棘层。提示SK皮损KC离开基底层进入基底浅层，不能立即启动终末分化程序，棘层细胞依然增殖活跃。与周围正常皮肤相比，SK表皮明显存在黑素小体降解障碍。

为了证实CTSL2在SK皮损形成中的作用，我们对5例SK皮损CTSL2 mRNA水平以及酶活性进行了检测，结果显示，与周围正常皮肤组织相比，SK皮损组织CTSL2 mRNA表达和酶催化活性均显著减低。最后，我们将人眼纯化的黑素小体样本与SK皮损组织裂解物共同孵育，透射电镜观察发现，SK皮损裂解物处理黑素小体的损伤率低于正常皮肤裂解物处理黑素小体的损伤率，推测SK皮损组织中CTSL2的表达减少，可能导致KC对黑素小体降解能力下降，造成皮损中大量黑素颗粒堆积。CTSL⁃/⁃基因敲除小鼠实验证实，CTSL表达缺陷KC对表皮生长因子（EGF）诱导的增殖反应明显增强，提示CTSL对EGF⁃EGF受体结合物降解障碍，EGF通过再循环方式刺激KC发生过度增殖［4］。

综上，我们的研究结果表明，SK皮损中CTSL2表达水平及酶活性减低影响KC对黑素小体的降解，是否直接参与SK皮损的病理发生有待进一步证实。

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