胶原诱导性关节炎炎症条件下诱导的调节性T细胞与B细胞的相互作用①

孔 宁 孙 娟 杨懿铭 邹和建 杨 洁 万伟国

(复旦大学附属华山医院风湿科，上海 200040)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种可以导致关节毁损、多脏器损害的系统性疾病，也是导致劳动力丧失的主要免疫性关节炎之一；T细胞和B细胞均参与了疾病的发生和发展[1,2]。B细胞，作为主要的免疫细胞之一，除了体液免疫，还在细胞免疫中发挥着重要作用。首先，B细胞可以作为抗原提呈细胞激活效应性T细胞分泌炎症因子，并且是效应性T细胞激活增殖的必需条件之一。取自μMT-/-NOD小鼠(缺乏B细胞的NOD小鼠模型)的T细胞与NOD小鼠(1型糖尿病的小鼠模型)的T细胞相比，丧失了对其自身抗原肽(GAD65)刺激的反应能力，不会进展为1型糖尿病[3]，去除B细胞后，即便有其他抗原提呈细胞的辅助，T细胞的增殖能力仍明显减弱[4]。其次，B细胞是自身反应性CD4+T细胞激活的必需条件[5]。已知，RA经典的动物模型—胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)的重要发病机制之一是淋巴细胞对自身抗原Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ，C Ⅱ)的免疫耐受异常，产生了针对CⅡ的特异性应答，抗原特异性的自身反应性CD4+T细胞被激活，在不同细胞因子的诱导下，分化成不同的效应性T细胞，包括Th17细胞、Th1细胞、Th2细胞等，并进一步分泌多种炎症因子，进而导致关节炎的发生和发展。尚有研究发现CD4+T细胞激活对B细胞的依赖仅表现在自身免疫性应答中[6,7]。再者，自身反应性CD4+T细胞尤其对表达共刺激分子(CD80、CD86)和MHC Ⅱ类分子的B细胞的刺激产生应答[8-10]。B细胞被激活后细胞表面共刺激分子(CD80、CD86)和MHC Ⅱ 类分子的表达会增加[11]，转而发挥作为专业抗原提呈细胞的功能。

调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)作为发挥免疫抑制作用的T细胞亚群，对维持机体免疫稳态发挥着重要作用，其数量和/或功能的异常可导致自身免疫性疾病的发生[12]，包括RA和CIA[13-18]。既往的研究已发现体外诱导的Tregs(induced T regulatory cells，iTregs)有着与体内天然的Tregs(natural T regulatory cells，nTregs)相似的表型和抑制功能，对CIA小鼠起到预防和早期治疗的作用[19,20]；并且在已发病的关节炎小鼠体内，foxp3+细胞发生了明显的扩增[19]，但扩增的机制尚不明确。有关Tregs免疫调节机制的研究发现，炎症环境下的BAFF转基因小鼠(BAFF，B cell activating factor belonging to TNF family，促进B细胞的成熟，维持B细胞的存活)体内，foxp3+Tregs扩增明显增多；而在B细胞缺乏的小鼠中，扩增现象消失[21]；由此可见，炎症环境下体内Tregs的扩增依赖于B细胞。本研究拟探讨在CIA小鼠的炎症环境下，iTregs与B细胞间的相互作用，进一步理解iTregs对CIA小鼠的预防和早期治疗作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8周龄雄性DBA1/J小鼠购自上海斯莱克实验动物中心，饲养在室温，相对湿度(55±10)%，照明/黑暗为12 h/12 h环境中，自由摄食及饮水。

1.1.2实验试剂 牛Ⅱ型胶原(CⅡ,Chondrex,Redmond,WA,USA)；完全弗氏佐剂(CFA,Difco,Detroit,MI,USA)；不完全弗氏佐剂(IFA,Difco)；CD4+T细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotec Technology & Trading,Shanghai,China)；抗CD25-PE单克隆抗体(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)；抗PE的磁珠(Miltenyi)；抗CD62L-PE单克隆抗体、抗CD19-PE单克隆抗体(BD)；10%胎牛血清(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA)；IL-2(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)、TGF-β(R&D Systems)和CD3/CD28单抗偶联磁珠(Miltenyi)；CD4-FITC、CD25-PE(BD)和foxp3-APC(eBioscience,San Diego,CA,USA)；CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC(BD)；羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE，CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit,Invitrogen,Germany)；CTLA-4-PE(CTLA-4，Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，细胞T淋巴细胞相关抗原4，BD)。

1.2方法

1.2.1CIA模型的诱导 牛Ⅱ型胶原(CⅡ)和完全弗氏佐剂按照1∶1 的体积比充分乳化，50 μl乳化液在小鼠尾根部皮下注射；初次免疫后第21天，CⅡ和不完全弗氏佐剂按照1∶1的体积比充分乳化，50 μl乳化液在小鼠尾根部皮下注射，完成CIA模型的诱导。在二次免疫后，隔天，按既定评分标准[17]进行评分和记录。

1.2.2细胞制备 CD4+CD62L+CD25-T细胞的制备：无菌分离DBA1/J小鼠的脾脏，研磨得单个细胞悬液，裂解红细胞，采用CD4+T细胞分选试剂盒分选得CD4+T细胞；分选所得的CD4+T细胞与抗CD25-PE单克隆抗体孵育后，加入抗PE的磁珠，分选出CD4+CD25-T细胞。CD4+CD25-T细胞先后加入抗CD62L-PE单克隆抗体、抗PE的磁珠再次孵育后，分选得到CD4+CD62L+CD25-T细胞。

CIA B细胞(CIA-B)和正常B细胞(N-B)的制备：分别无菌分离DBA1/J小鼠或初次免疫后第35天已有关节炎发作的CIA小鼠的脾脏，研磨得单细胞悬液，裂解红细胞，加入抗CD19-PE单克隆抗体，然后与抗PE的磁珠共孵育后分选出CD19+细胞。

1.2.3细胞培养 经典iTregs的生成：分离自正常DBA1/J小鼠脾脏的CD4+CD62L+CD25-T细胞，采用RPMI1640、10%胎牛血清、40 U/ml IL-2、2 ng/ml TGF-β和CD3/CD28单抗偶联磁珠(细胞∶磁珠=4∶1)培养4 d。体外，不同B细胞诱导Tregs的生成：CD4+CD62L+CD25-T细胞分别与N-B和CIA-B以 1∶1 细胞比例在100 U/ml IL-2和5 ng/ml TGF-β条件下共培养3 d；收集细胞，标记CD4-FITC、CD25-PE和foxp3-APC，流式细胞仪检测CD4+CD25+foxp3+细胞的百分比。经典iTregs与CIA-B细胞共培养：经典iTregs与CIA-B以1∶1比例共培养，同时加入IL-2(100 ng/ml) 和CⅡ(200 ng/ml) 共培养 3 d，3 d后收集培养的细胞，分别标记CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC，流式细胞仪分别检测CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+细胞的百分比。

1.2.4细胞增殖实验 经典iTregs与CIA-B细胞共培养：iTregs标记CFSE，与CIA-B细胞以1∶1比例共培养；同时加入IL-2(100 ng/ml) 和CⅡ(200 ng/ml)共培养3 d，3 d后收集细胞，流式细胞仪检测CFSE+细胞的百分比。

1.2.5Transwell实验 经典iTregs与CIA-B以1∶1比例共培养，iTregs置于下层，CIA-B细胞置于上层；同时加入IL-2(100 ng/ml)和CⅡ(200 ng/ml) 共培养3 d，3 d后收集培养的细胞。①标记抗CTLA-4-PE，流式细胞仪检测CTLA-4+细胞的百分比；②分别标记CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC，流式细胞仪分别检测CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+细胞的百分比。

1.2.6抗体染色和流式细胞仪检测

1.2.6.1约1×106的培养细胞加入抗CD4-FITC和CD25-PE单抗孵育0.5 h后，1×PBS清洗，固定并破膜，加入抗foxp3-APC单抗孵育，1×PBS清洗后上机检测。

1.2.6.2约1×106的培养细胞分别加入抗CTLA-4-PE单抗孵育半小时，1×PBS清洗后上机检测；加入抗CD80-FITC和CD19-APC、抗CD86-FITC和CD19-APC、抗MHCⅡ-FITC和CD19-APC抗体，1×PBS清洗后上机检测。

2 结果

2.1CIA B细胞(CIA-B)较正常B细胞(N-B)诱导更多Tregs的生成 已知CIA-B共刺激分子表达上调而具有更强的抗原提呈能力，并且在已发病的CIA关节炎小鼠体内foxp3+细胞可以进一步扩增，由此本研究设立下述实验观察CIA-B对foxp3+细胞(Tregs)的诱导作用。将CD4+CD62L+CD25-细胞分别以CIA-B或N-B作为抗原提呈细胞，加以IL-2和/或TGF-β共培养3 d，收集培养的细胞，流式细胞仪检测CD25+foxp3+细胞的表达。如图1所示，CIA-B较N-B诱导更多的CD25+foxp3+细胞的生成[(54.497±1.830)% vs(45.783±0.484)%，P=0.010]。

2.2CIA-B促进iTregs的增殖并上调iTregs细胞表面CTLA-4的表达 观察CIA-B作为抗原提呈细胞是否可以直接作用于iTregs。将iTregs标记CFSE后与CIA-B按细胞数1∶1 的比例共培养3 d，实验分为iTregs组和iTregs+CIA-B组，3 d后收集细胞，流式细胞仪检测iTregs-CFSE的表达即iTregs的增殖；结果显示与CIA-B共培养后，iTregs的增殖明显增加[见图2A，(47.920±2.049)% vs(23.960±0.493)%，P<0.000 1]。另一组实验，将iTregs与CIA-B按细胞数1∶1的比例共培养3 d，实验分为iTregs+CIA-B组和iTregs+CIA-B Transwell组(iTregs+CIA-B T)，3 d后收集细胞，流式细胞仪检测CTLA-4的表达；结果显示与CIA-B共培养后，iTregs细胞表面CTLA-4的表达上调，并且该作用通过iTreg与CIA-B细胞间的直接接触而实现[见图2B，(76.147±4.338)% vs(5.910±0.565)%，P<0.000 1]。

图1 CIA-B较N-B诱导更多Tregs的生成Fig.1 CIA-B induced more Tregs production than N-B

图2 CIA-B促进iTregs的增殖并上调iTregs细胞表面CTLA-4的表达Fig.2 CIA-B promoted iTregs proliferation and CTLA-4expression

图3 iTregs通过细胞直接接触促进CIA-B细胞表面共刺激分子和MHCⅡ类分子的表达Fig.3 iTregs increased the expressions of co-stimulators(CD80,CD86) and MHCⅡ on CIA-B through a cell-contact pathway

表1iTregs通过细胞直接接触促进CIA-B细胞表面共刺激分子和MHCⅡ类分子的表达

Tab.1iTregsincreasedtheexpressionsofco-stimulators(CD80,CD86)andMHCⅡonCIA-Bthroughacell-contactpathway

ItemCIA-BiTregs+CIA-BiTregs+CIA-B TCD8029.235±1.386504.645±90.7771)2)77.818±2.261CD8655.443±4.018950.743±97.1023)4)75.900±0.841MHCⅡ641.930±24.3475170.890±309.5905)6)690.165±42.712

Note：1)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P=0.001 9；2)iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P=0.003 3；3)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P<0.000 1；4)iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P=0.001；5)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P<0.000 1；iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P<0.000 1.

2.3iTregs促进CIA-B细胞表面共刺激分子(CD80，CD86)和MHCⅡ类分子的表达 将iTregs与CIA-B细胞按照1∶1 的细胞比例共培养3 d，实验设为CIA-B组、iTregs+CIA-B组和iTregs+CIA-B Transwell实验组(iTregs+CIA-B T)；3 d后，收集细胞，流式细胞仪分别检测CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+细胞的表达情况。结果如图3和表1所示，研究发现与iTregs共培养后，CIA-B细胞表面共刺激分子(CD80，CD86)和MHCⅡ类分子的表达都显著升高；在进行Transwell实验将iTregs与CIA-B细胞隔离开共培养后，三者的表达都显著回落甚至是接近共培养前的水平。

3 讨论

已知，B细胞通过B细胞表面抗原受体和表达于T细胞表面的一些分子配体相结合，实现两者间的相互作用[22]，从而调控效应性T细胞的激活、调节性T细胞的生成及抑制性免疫应答[23]。在这种相互作用中，B细胞被激活而表达更多的共刺激分子，或分化成浆细胞；同时表达更多共刺激分子的B细胞可以作为抗原提呈细胞通过提呈特异性抗原而激活自身反应性T细胞[24]。任何对B细胞和T细胞相互作用的影响都可能诱发自身免疫性疾病的发生和发展[22]。

既往研究发现，在将iTregs注射入已发病的CIA小鼠后，iTregs在体内明显扩增，但具体机制不详[19]；结合已有的BAFF转基因小鼠研究结果[21]，推测在CIA已发病的关节炎小鼠的炎症环境下，iTregs的扩增也有赖于B细胞。研究结果发现，已发病的CIA小鼠的B细胞较正常DBA1/J小鼠的B细胞诱导更多Tregs细胞(foxp3+细胞)的生成。不仅如此，CIA小鼠的B细胞还可以促进iTregs本身的增殖，并通过细胞直接接触的方式上调iTregs细胞表面CTLA-4的表达。

既然B细胞与T细胞存在着明确的相互作用，研究随后观察了iTregs对B细胞的可能作用方式。结果意外地发现，iTregs显著上调了B细胞表面共刺激分子(CD80、CD86)和MHCⅡ类分子的表达，这三者代表着B细胞的激活和抗原提呈能力；这个作用依赖于细胞直接接触而实现。

iTregs又是如何避免B细胞持续过度地活化呢？已有研究证实，Tregs可通过CD28/CD80/86/CTLA-4平衡直接抑制B细胞的功能[23]。表达于B细胞表面的CD80/CD86可以通过与两种表达于T细胞表面的受体分子结合而分别发挥抑制或促进T细胞功能的作用，这两种受体分子包括CTLA-4和CD28。CTLA-4又称CD152,是下调免疫应答的一种关键蛋白受体，与CD28共享CD80/CD86分子配体，而CTLA-4与CD80/CD86分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节[25-29]。CTLA-4可表达于人和小鼠的Tregs表面，是Tregs发挥免疫抑制功能的重要途径之一[30-32]。iTregs表面的CTLA-4可以结合CD80/CD86发挥对B细胞甚至是效应性T细胞的抑制作用；而CD80/CD86则可与T细胞表面的CD28结合起到促进效应性T细胞增殖的作用；已知CTLA-4可以竞争性结合CD80/CD86。由此可见，iTregs可以通过上调B细胞表面CD80、CD86和MHCⅡ类分子的表达，增强其抗原提呈的能力，进而促进iTregs本身的增殖并诱导更多Tregs的生成；同时这些B细胞可以上调iTregs表面CTLA-4的表达，通过CTLA-4与CD80/CD86的结合直接抑制B细胞并可直接和或间接抑制效应性T细胞，而利于免疫抑制功能的发挥并避免B细胞的过度激活。

本研究探讨了CIA关节炎小鼠炎症环境下iTregs与B细胞的相互作用模式，推动了iTregs对关节炎小鼠治疗作用机制的研究，将有助于RA细胞免疫治疗的发展。

参考文献：

[1] Angelotti F,Parma A,Cafaro G,etal.One year in review 2017:pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Clin Exp Rheumatol，2017，35(3):368-378.

[2] Bugatti S,Vitolo B,Caporali R.B cells in rheumatoid arthritis:from pathogenic players to disease biomarkers[J].Biomed Res Int，2014，2014:681678.

[3] Noorchashm H,LieuYK,Noorchashm N,etal.I-Ag7-mediated antigen presentation by B lymphocytes is critical in overcoming a checkpoint in T cell tolerance to islet beta cells of nonobese diabetic mice[J].J Immunol，1999，163:743-750.

[4] Serreze DV,Fleming SA,Chapman HD,etal.B lymphocytes are critical antigen-presenting cells for the initiation of T cell-mediated autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice[J].J Immunol 1998，161:3912-3918.

[5] Villadangos JA,Schnorrer P.Intrinsic and cooperative antigen-presenting functions of dendritic-cell subsets in vivo[J].Nat Rev Immunol,2007，7:543-555.

[6] Marino E,Villanueva J,Walters S,etal.CD4(+)CD25(+)T-cells control autoimmunity in the absence of B-cells[J].Diabetes，2009，58:1568-1577.

[7] Bouaziz JD,Yanaba K,Venturi GM,etal.Therapeutic Bcell depletion impairs adaptive and autoreactive CD4+T cell activation in mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007，104:20878-20883.

[8] Marino E,Batten M,Groom J,etal.Marginal-zone B-cells of nonobese diabetic mice expand with diabetes onset,invade the pancreatic lymph nodes,and present autoantigen to diabetogenic T-cells[J].Diabetes,2008，57:395-404.

[9] Wheat W,Kupfer R,Gutches DG,etal.Increased NF-kappaB activity in B cells and bone marrow-derived dendritic cells from NOD mice[J].Eur J Immunol,2004，34:1395-1404.

[10] Hussain S,Delovitch TL.Dysregulated B7-1 and B7-2 expression on nonobese diabetic mouse B cells is associated with increased T cell costimulation and the development of insulitis[J].J Immunol,2005，174:680-687.

[11] Wither JE,Roy V,Brennan LA,etal.Activated B cells express increased levels of costimulatory molecules in young autoimmune NZB and(NZB x NZW)F(1) mice[J].Clin Immunol，2000，94(1):51-63.

[12] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,etal.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol，1995，155(3):1151-1164.

[13] Van Amelsfort JM,Jacobs KM,Bilsma JW,etal.CD4+CD25+regulatory T cells in rheumatoid arthritis:differences in the presence,phenotype,and function between peripheral blood and synovial fluid[J].Arthritis Rheum，2004，50:2775-2785.

[14] Ehrenstein MR,Evans JG,Singh A,etal.Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti-TNF-α therapy[J].J Exp Med，2004，200:277-285.

[15] Mottonen M,Heikkinen J,Mustonen L,etal.CD4+CD25+T cells with the phenotypic and functional characteristics of regulatory T cells are enriched in the synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis[J].Clin Exp Immunol，2005，140:360-367.

[16] Flores-Borja F,Jury EC,Mauri C,etal.Defects in CTLA-4 are associated with abnormal regulatory T cell function in rheumatoid arthritis[J].Proc Natl Acad Sci，2008，105:19396-19401.

[17] Cao D,Malmström V,Baecher-Allan C,etal.Isolation and functional haracterization of regulatory CD25brightCD4+cells from the target organ of patients with rhumatoid arthritis[J].Eur J Immunol，2003，33(1):215-223.

[18] Lawson CA,Brown AK,Bejarano V,etal.Early rheumatoid arthritis is associated with a deficit in the CD4+CD25highregulatory T cell population in peripheral blood[J].Rheumatology(Oxford)，2006，45:1210-1217.

[19] Kong N,Lan Q,Chen M,etal.Antigen-specific transforming growth factor β-induced Treg cells,but not natural Treg cells,ameliorate autoimmune arthritis in mice by shifting the Th17/Treg cell balance from Th17 predominance to Treg cell predominance[J].Arthritis Rheum，2012，64(8):2548-2558.

[20] Kong N,Lan Q,Chen M,etal.Induced T regulatory cells suppress osteoclastogenesis and bone erosion in collagen-induced arthritis better than natural T regulatory cells[J].Ann Rheum Dis，2012，71(9):1567-1572.

[21] Walters S,Webster KE,Sutherland A,etal.Increased CD4+FoxP3+T cells in BAFF-transgenic mice suppress T cell effector responses[J].J Immunol,2009，182:793-801.

[22] Tangye SG,Brink R,Goodnow CC,etal.SnapShot:interactions between B cells and T cells[J].Cell，2015，162(4):926-926.

[23] Brzostek J,Gascoigne NR,Rybakin V,etal.Cell type-specific regulation of immunological synapse dynamics by B7 ligand recognition[J].Front Immunol，2016，7:24.

[24] Murphy,Kenneth.Janeway′s Immunobiology[M].8th Edition.New York,NY:Garland Science，2012:351.

[25] Oderup C,Cederbom L,Makowska A,etal.Cytotoxic T lymphocyte antigen-4-dependent down-modulation of costimulatory molecules on dendritic cells in CD4+CD25+regulatory T-cell-mediated suppression[J].Immunology，2006，118：240-249.

[26] Onishi Y,Fehervari Z,Yamaguchi T,etal.FoxP3+natural regulatory T cells preferentially form aggregates on dendritic cells in vitro and actively inhibit their maturation[J].Proc Natl Acad Sci，2008，105：10113-10118.

[27] Wing K,Onishi Y,Prieto-Martin P,etal.CTLA-4 control over FoxP3+regulatory T cell function[J].Science，2008，322：271-275.

[28] Ville S,Poirier N,Blancho G,etal.Co-Stimulatory blockade of the CD28/CD80-86/ CTLA-4 balance in transplantation:impact on memory T cells?[J].Front Immunol，2015，6:411.

[29] Chikuma S.CTLA-4,an essential immune-checkpoint for T-cell activation[J].Curr Top Microbiol Immunol，2017，410：99-126.

[30] Read S,Malmstrom V,Powrie F.Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation[J].J Exp Med，2000，192：295-302.

[31] Takahashi T,Tagami T,Yamazaki S,etal.Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4[J].J Exp Med，2000，192：303-310.

[32] Dieckmann,D,Plottner,H,Berch-told,S,etal.Ex vivo isolation and characterization of CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties from human blood[J].J Exp Med，2001，193：1303-1310.