宫颈癌及癌前病变中的HPV-16的整合感染状态

熊矿辉，王丽霞，周 红

(浙江省医疗健康集团杭州医院妇产科，浙江 杭州 310022)

生殖道人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染诱发女性宫颈癌是目前普遍认可的主要因素[1]。据相关流行病学研究结果显示，仅为HPV感染不足以导致发生宫颈癌，而在受到高危型HPV感染且发生HPV病毒与宿主基因组发生整合状态时，宫颈上皮细胞会发生恶性转化，从而可能导致宫颈癌的发生。在宿主不同的DNA开放读码框架处，HPV均可以在此与宿主基因组发生整合[2-3]。其中，不稳定的E2基因铰链区是高危HPV整合宿主基因组最常见的缺失或断裂部位[4]。在高危HPV病毒类型中，最常见的就是人类乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16)[5-6]，本次研究中，采用重叠定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术探讨各宫颈病变组织中HPV-16 E2基因的缺失从而判断HPV-16与宿主基因组的整合情况，并初步探讨HPV-16整合状态及其与诱发宫颈癌之间的关系和临床意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1临床标本

选取2012年2月至2014年12月在浙江省医疗健康集团杭州医院活检，宫颈锥切术及广泛性全子宫切除术后获得的宫颈病变组织存档蜡块标本252例为研究组，并根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)女性生殖道肿瘤组织学分型标准，将标本分别划分为48例宫颈癌及204例宫颈上皮内瘤样病变组织(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，其中包括CIN Ⅰ125例,CIN Ⅱ46例，CIN Ⅲ33例。另外将同时期因子宫肌瘤于我院行子宫全切术后提取的20例正常宫颈上皮组织作为对照组。所用标本患者均为已婚妇女且在取检前均未行任何化疗或放射治疗，年龄为27～68岁，平均年龄46岁。将蜡块标本进行常规切片和苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后显微镜下观察，取细胞无异常的组织切片用于进一步实验。所有研究对象均知情同意。

1.1.2细胞系

细胞系在37℃、5%CO2、饱和湿度环境下，将人宫颈癌细胞株SiHa、CasKi(美国生物物种保藏中心)分别于10%胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)培养液和洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)培养液中。

1.2方法

1.2.1石蜡切片的DNA的提取

提取石蜡切片中的DNA 对每块蜡块标本中进行1μm厚切片，然后每块蜡块各取3片进行下一步试验。对切片进行脱蜡并分别加入30μL蛋白酶K溶液，30μL 20%SDS和500μLTES溶液，于56℃水浴72h；继续按比例用酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提2次，然后进行离心并弃去上清液后加入无水乙醇2倍体积和3mol/L的乙酸钠1/10体积，再次离心后弃上清液并于真空泵中进行沉淀干燥，最后于沉淀中加入少量TE缓冲液进行溶解。完成DNA的提取。

1.2.2 HVP-16感染的确定

HPV-16感染的确定当在DNA水平和蛋白质水平两个分子水平上均检测阳性可以判断HPV-16感染。①DNA水平确定HPV-16感染：用PCR检测计算机软件辅助设计的HPV-16 E7基因以确认为HPV-16感染，设计的HPV-16 E7基因序列为：上游引物5’-AGAAACCCAGCTGTATCAT-3’，下游引物5’-TTATGGTTTCTGAGAAGAGA-3’；②蛋白质水平确定HPV-16感染:采用免疫组化SP法检测切片组织中HPV-16 E7的表达的蛋白质水平从而确定HPV-16感染，具体步骤参照文献所述[7]。

1.2.3确定HPV-16整合

HPV-16与宿主基因组织整合的确定采用重叠PCR法分别扩增确认为HPV-16感染标本的HPV-16 E2基因中的3个相互间有序列的的交叉小片段来确定是否存在病毒整合情况，A、B、C 3个交叉小片段的引物序列分别如下，见表1。

表1各片段的引物序列

Table 1 Sequence of primers in each fragment

片段上游引物序列(5'-3')下游引物序列(5'-3')A(475p)AGCACGAGGGACAGGAAAAACTTGACCCTCTACCACAGTTACTB(477p)TTGTGAAGAAGCATCAGTAACTTAAAGTATTAGCATCACCTTC(176p)GTAATAGTAACACTACACCCATAGGATGCAGTATCAAGATTTGTT

当片段A、B、C 3个不能同时阳性扩增时，提示HPV-16 E2基因存在缺失，从而代表HPV-16与宿主基因组发生了整合。HPV-16发生整合感染仅仅能扩增出C片段，而发生HPV-16的游离感染的标本能扩增出A、B、C 3个片段(以Caski和SiHa细胞株的DNA作为阳性)，见图1。

注：M为marker;1为Caski;2为SiHa;3为CIN ;4为CIN ;5，6为Cervical Carcinoma(integrated);7为control

图1重叠PCR扩增HPV-16 E2不同片段判断HPV-16整合状态

Fig. 1 Overlapping PCR amplification of different fragments of HPV-16 E2 to judge HPV-16 integration

1.3统计学方法

应用SPSS 10.0统计软件对文中相关数据进行分析，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验。P<0.05时为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HPV-16感染确定情况

根据PCR扩增HPV-16 E7基因结果显示，正常宫颈上皮组织，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的组织HPV-16感染例数分别为1、30、20、18和34例，而对应的根据免疫组化蛋白测定确定HPV-16感染结果为阳性例数分别为2、28、19、16和33例。因此正常宫颈上皮组织，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的组织中两者均阳性的确定HPV-16感染的例数分别为1、23、17、15和33例，且各组HPV-16感染率为5.0%(1/20)、18.4%(23/125)、36.9%(17/46)、45.5%(15/33)、68.8%(33/48)，随着病变程度的增高感染率也增高，差异有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2不同病变程度宫颈上皮组织的HPV-16感染率的比较

Table 2 Comparison of HPV-16 infection rates among

cervical lesions with different degrees

2.2 HPV-16与宿主基因组整合的确定

根据重叠PCR扩增HPV-16 E2基因不同片段确定HPV-16整合结果提示，在确定HPV-16感染的标本中，正常宫颈上皮组织标本的结果提示为游离感染，而CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌组织标本的整合例数分别为4、3、5和18例，整合率分别为16.7%(4/24)、18.8%(3/16)、35.7%(5/14)、58.1%(18/31)，随着病变程度的增高整合率也增高，差异有统计学意义(P=0.0056)，见表3。

表3不同病变程度宫颈上皮组织的HPV-16整合率的比较

Table 3 Comparison of HPV-16 integration rates

among cervical lesions with different degrees

3讨论

3.1 HPV-16感染与宫颈病变程度关系

宫颈癌是世界上妇科肿瘤中最常见的一种恶性肿瘤，据相关统计学研究显示世界上每年约有19万女性死于宫颈癌，其中超过半数案例是发生在发展中国家。我国每年的宫颈癌病例约为10万，占世界总发病人数的1/3[8]，所以宫颈癌严重的影响着我国女性的生命健康，对此进行的防治工作刻不容缓。

直到目前，有大量的实验室研究以及流行病学研究结果都证明，HPV病毒感染是引起宫颈癌发生的最主要因素，并且高危型的HPV病毒持续感染是主要的病因[2,9]。在多种高危型HPV类型中，HPV-16感染是最常见的引起宫颈癌发生的主要类型。本次研究结果显示，HPV-16感染率随着宫颈病变程度级别的加重而呈上升趋势；且HPV-16与宿主基因组的整合率在宫颈癌患者中高达68.8%，并且随着宫颈病变程度的加重整合率出现明显的提高，提示HPV-16感染与宫颈病变程度呈正相关，并且提示宫颈病变发生恶性转化的过程中HPV-16整合状态的存在是高危因素。

3.2 HPV-16整合感染与宫颈病变组织恶化之间的相关性以及作用机制

有研究表明，多数的HPV感染是一过性的，一般病毒会在感染后的6～12个月内消退。但是当在宿主的防御机制发生缺陷或者基因发生突变的时候，HPV病毒的基因片段则会与宿主发生改变的细胞基因组发生相关整合，因而导致细胞的基因调控机制出现失调的情况[10]。若HPV病毒的繁殖停止在复制周期的某一时相，就会发生HPV的持续感染，HPV特别是高危型HPV的持续性及反复性感染可能会导致宫颈细胞发生恶性转化。有研究认为宫颈组织发生癌变的过程中的早期事件有可能就是HPV与宿主基因组发生整合[11-12]，但是关于其整合的具体的发生时相目前尚未有统一的结论，还需要进一步的研究讨论。目前有研究表示在宿主宫颈病变组织中，HPV并非只是以单纯的整合感染的状态存在，因此HPV-16整合感染与宫颈病变组织恶化之间的相关性以及作用机制还需要进一步的研究。但是HPV-16作为恶化的高危因素，在预测宫颈癌前病变的转归上存在着一定预测作用。

3.3 HPV-16能够提高宫颈癌初步筛选特异度

HPV DNA检测方法是目前我国最普遍的宫颈癌初步筛选方法[3]，但不能发现HPV病毒基因是否与宿主基因组发生了整合感染[13]。在本次研究中，在CIN发生HPV-16感染的病例中就有22.3%发生HPV-16整合，即使在CINⅠ中整合率就有16.7%，说明高危HPV整合在宫颈病变的发生的早期中就有整合并且贯穿整个癌变过程。因此采用简单、快速的HPV DNA检测和高危HPV整合状态的检测，能够提高宫颈癌初步筛选特异度。

综上所述， HPV-16的整合感染可能导致宫颈病变恶化，在HPV DNA检测的基础上联合对高危HPV整合感染状态进行检测有利于提高宫颈癌筛查特异度并在早期预测宫颈病变的转归。

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