RNA结合蛋白QKI-5、Ezrin在浆液性卵巢癌中的研究

朱士杰，施正祥

(1.浙江大学舟山医院妇产科；2.神经内科，浙江 舟山 316000)

在人类的卵巢肿瘤患者中，其疾病的病理类型复杂，其中上皮性卵巢肿瘤的患者占大多数，包括黏液性、子宫内膜样以及浆液性的肿瘤及三种主要的亚型，三种亚型中浆液性的卵巢肿瘤患者占大多数[1]。浆液性卵巢癌具有容易转移、早期临床症状不明显以及散播广泛的生物学行为，在患者中超过70%的在明确诊断的时候已经处于肿瘤的晚期，病人的5年生活率比较低，仅仅有30%[2]。浆液性的卵巢肿瘤由于早期的症状不明显，所以其死亡率已经成为妇科的恶性肿瘤中的首位，已然成为威胁人类女性健康的主要的癌症之一[3]。浆液性卵巢癌的发生以及发展的机制尚未明确，所以寻找其的发病相关基因，并且及时阻断发病过程的关键环节在目前具有至关重要的意义[4]。

近些年的研究数据显示，miRNA通过调控有些致癌基因以及抑制肿瘤细胞基因的表达从而影响肿瘤细胞的迁移、增殖以及凋亡等的过程[5]。亦有大型研究显示，埃兹蛋白(Ezrin)在癌细胞中的异常表达，能够在恶性肿瘤细胞的转移以及浸润的过程中发挥着至关重要的作用[6]。RNA结合蛋白QKI-5作为一个重要的转录调节因子，能够调节目的mRNA的稳定性、定位以及翻译的效率，从而影响细胞的生理以及病理的发展过程[7]。本研究通过检测RNA结合蛋白QKI-5、Ezrin等指标在正常人群的卵巢上皮组织和浆液性卵巢癌患者组织中表达的差异，探讨其与浆液性卵巢癌发生以及发展的相关性。

1资料与方法

1.1研究对象

选取2012-2017年在舟山医院就诊的卵巢浆液性肿瘤患者40例，纳入标准：①年龄满18周岁；②患者均未接受过新辅助化疗；③未合并其他严重合并症，如严重的肝肾功能不全等；④神志清，临床依从性好；⑤将研究告知患者以及家属，得到同意并且签署知情同意书。排除标准：①诊断不明确；②合并其他严重的疾病；③患者临床依从性差。在我院门诊招募20名健康受试者。

根据上述纳入以及排除标准，共有40名患者被纳入本研究当中，作为观察组研究对象，招募的20名健康受试者作为对照组。本研究经过我院伦理委员会审查通过。

1.2方法

1.2.1石蜡组织切片制备

将组织放置于5倍体积的10%福尔马林溶液中，并进行24h的固定。将组织中的水分在由低到高浓度梯度的乙醇中脱去，将玻片在二甲苯中进行浸泡至组织透明。在热板上将组织中所含软硬石蜡进行融化，并将其平稳转移置冷冻面板上，充分进行冷却凝固。然后将蜡块固定好，在42℃ddH2O中，将3μm厚组织展平，在防脱载玻片表面，将切片平整贴附，将其放置于玻片盒中风干过夜。

1.2.2标本的处理

收集的观察组的患者，其术中切下的癌组织直接放入冻存管中，放在液氮中干燥，并转移至-80℃冰箱中保存。对照组的卵巢上皮细胞，是在开腹手术中或术后使用无菌细胞刷刷取卵巢表面的卵巢上皮细胞直接放入加入1mL Trizol的无菌的1.5mLEP管中，术后放入液氮中保存。

1.2.3 RNA结合蛋白QKI-5的测定

将40例观察组浆液性肿瘤患者的肿瘤组织样品和20例对照组受试者卵巢上皮细胞样品取出，按照试剂盒说明书的操作方法对于组织样品进行处理之后，使用实时定量的(polymerase chain reaction，PCR)方法对于组织样本中的RNA结合蛋白QKI-5的表达水平进行测定，并且及时记录数据。

1.2.4 Ezrin的测定

将40例观察组浆液性肿瘤患者的肿瘤组织样品和20例对照组受试者卵巢上皮细胞样品取出，采用免疫组织化学多聚体标记两步法对于样本进行检测，其Ezrin在卵巢肿瘤组织与正常的卵巢上皮组织中的表达评分由其染色强度划分成为4个等级，染色阳性百分比也划分为4个等级。

1.3统计学方法

对于RNA结合蛋白QKI-5与 Ezrin测定结果的判断是由两名资深的主任医师在双盲下读取，并且取均值进行统计处理。本研究中的所有数据全部采用统计学软件SPSS 19.0进行分析，计量资料使用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料使用例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1浆液性卵巢癌组织和正常卵巢上皮细胞中QKI-5 mRNA水平的差异

QKI-5 mRNA在浆液性卵巢癌患者卵巢组织中的表达显著的下调，差异具有统计学的意义(t=2.71，P=0.01)，这说明QKI-5在卵巢肿瘤组织中可能是一种抑制癌细胞的基因，见图1。

注：*表示P<0.0001。

图1浆液性卵巢癌组织和正常卵巢上皮细胞中QKI-5mRNA水平的比较

Fig. 1 Comparison of QKI-5 mRNA levels in serous ovarian cancer tissues and normal ovarian epithelial cells (*meansP<0.0001)

2.2浆液性卵巢癌组织和正常卵巢上皮细胞中Ezrin mRNA水平的差异

Ezrin在浆液性卵巢癌患者卵巢组织中的表达显著的下调，下调大约4倍，差异具有统计学意义(t=3.72，P<0.01)，见图2。

注：*表示P<0.0001。

图2浆液性卵巢癌组织和正常卵巢上皮细胞中Ezrin水平的比较

Fig. 2 Comparison of Ezrin levels in serous ovarian cancer tissues and normal ovarian epithelial cells (*meansP<0.0001)

2.3卵巢肿瘤组织和正常卵巢上皮组织中Ezrin的比较

Ezrin染色强度的划分，依次为阴性：-；弱阳性：+；阳性：++；强阳性：+++，观察组40例卵巢肿瘤组织样品中，Ezrin显示阳性的有39例，仅仅有1例染色结果阴性，其阳性率为97.50%，见图3。在20例对照组受试者卵巢上皮组织细胞中，其阳性几率为100.00%，两组之间比较无显著性差异(χ2=0.51，P=0.48)，见表1。

图3 Ezrin染色强度的划分

3讨论

卵巢肿瘤是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其致死率一直稳居妇科肿瘤的首位[8]。在卵巢肿瘤的类型中，浆液性的卵巢肿瘤占大多数。但是对于浆液性的卵巢肿瘤的发生以及发展机制，至今尚未清楚。近年来，越来越多的研究均围绕浆液性卵巢癌组织的发病以及发展机制进行[9]。最近的研究均证实，浆液性的卵巢肿瘤的发生以及发展机制与输卵管的上皮细胞病变有相关性。目前，有研究已经选取了输卵管的上皮细胞组织作为对照，用来研究上皮性卵巢肿瘤的发病机制[10]。

3.1不同卵巢组织上皮细胞中QKI-5 mRNA的差异

QKI是一种STAR家族的结合蛋白，在其进化的过程中具有高度保守的特征，并且在人类机体的神经系统发育过程中，是髓鞘发育的至关重要的蛋白质之一。在小鼠中，QKI基因的突变能够导致小鼠在出生之前就死于心血管肌肉系统的发育缺陷，或者在小鼠出生之后，临床表现为快速的震颤以及强直性的惊厥发作[11]。QKI在血管的发生、细胞粘附、细胞生长以及细胞凋亡等的过程中，亦发挥着及其的调节作用。QKI-5在神经管的发育中，存在于多种细胞中均有表达，在成体的神经元中反而没有表达[12]。在QKI的家族中，只有QKI-5在胚胎的形成过程中亦有表达，是其发育过程中表达量最高的异构体[13]。先前的研究结果表明，QKI-5在多种肿瘤组织中的表达均比较低，可能影响肿瘤组织细胞的分化与增殖[14]。然而，QKI-5在卵巢肿瘤细胞中的表达趋势以及细胞学功能尚不清楚。在本研究中，QKI-5 mRNA在浆液性卵巢癌患者卵巢组织中的表达显著的下调，且差异具有统计学的意义(P<0.05)，这说明QKI-5在卵巢肿瘤组织中可能是一种抑制癌细胞的基因。

3.2浆液性卵巢癌组织和正常卵巢上皮细胞中Ezrin mRNA水平

在本研究中，Ezrin mRNA在浆液性卵巢癌患者卵巢组织中的表达显著的下调，下调大约4倍，并且差异具有统计学的意义(P<0.05)。Ezrin 蛋白在2004年采用基因芯片的高等技术，在两种间叶来源以及高低转移的能力不同的骨肉瘤以及横纹肌肿瘤中发现的[15]。有研究表示，Ezrin是细胞膜和细胞骨架之间的连接蛋白，参与细胞膜区域的整合调节，以及细胞膜区域的稳定性的调控，同时Ezrin能够调节细胞膜内外的信号转导，但是其在肿瘤组织中的作用却尚未达成统一的意见[16]。有研究者采用免疫组织化学检测的技术进行检测，发现Ezrin在几种软组织肿瘤中存在较高的表达，比如脂肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、滑膜肉瘤以及恶性外周神经鞘瘤等，并且Ezrin和上述几种软组织肉瘤的浸润性的生长过程有着密切的相关性[17]。

3.3浆液性卵巢癌组织和正常卵巢上皮细胞中Ezrin的蛋白水平

在本研究中，观察组的Ezrin显示阳性率为97.5%，而对照组受试者卵巢上皮组织细胞中，其阳性几率为100%。有研究亦发现，Ezrin在子宫内膜肿瘤细胞中的表达较高，并且其的高表达行为与患者的总生存期呈现反比例的关系，同时发现Ezrin能够作为侵袭性子宫内膜肿瘤的独立的危险因素存在[18]。但是也有很多研究发现，Ezrin在肿瘤组织中出现表达下调的现象，并且还存在重新定位的可能性，过度表达的Ezrin可能抑制肿瘤细胞的发生以及发展过程[19]。有研究者发现，Ezrin和Moesin在结直肠肿瘤患者中的表达有下调的现象，并且存在着重新定位表达在细胞膜上的现象，Ezrin的表达和Dukes的分期呈现负相关的关系[20]。

综上所述，RNA结合蛋白QKI-5、Ezrin的表达下调与浆液性卵巢癌患者肿瘤组织的发生发展等的临床病理过程息息相关，所以这两个指标有望成为卵巢癌早期诊断指标，并为卵巢癌患者临床治疗提供新思路。

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