miR181基因rs16927589位点单核苷酸多态性在中国广西人群中的分布特点

王春芳 雷茗 庞晓霞 黄华佗 王俊利 韦贵将 韦叶生

【摘要】目的分析miR181基因rs16927589位點单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在中国广西地区人群中的分布特点，并比较其基因型和等位基因频率与其他种族和地区人群间的分布差异。方法采用SNaPshot SNP技术和DNA测序技术检测299例中国广西人群rs16927589位点SNPs，用统计学方法分析其基因型和等位基因频率与国际人类基因组单体型图（Haplotype map，HapMap）计划公布的北京人群（HapMapHCB）、日本人群（HapMapJPT）、肯尼亚人群（HapMapLWK）、印度人群（HapMapGIH）及欧洲人群（HapMapCEU）间的差异。结果中国广西人群存在miR181基因rs16927589多态性，有TT、TC和CC三种基因型，其频率分别为73.6%、25.4%和10%，含T和C两种等位基因，频率分别为86.3%和13.7%，两者男女组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；与HapMapHCB人群比较差异无统计学意义（P>0.05），但与HapMapGIH、HapMapLWK、HapMapJPT及HapMapCEU比较差异均有统计学意义（P<0.05或0.01）。结论在中国广西人群存在miR181基因rs16927589多态性，且在不同地域和种族人群间比较存在差异。不同种族和地区人群SNP差异可能是miR181基因相关疾病在临床表现和发病率不同的重要因素之一。

【关键词】miR181基因；单核苷酸多态性；种族

中图分类号：R394 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2018.02.001

Distribution character of SNP at rs16927589 locus of

miR181 gene in Guangxi population of China

WANG Chunfang，LEI Ming，PANG Xiaoxia，HUANG Huatuo，WANG Junli，WEI Guijiang，WEI Yesheng

（Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】ObjectiveTo analyze the distribution character of （single nucleotide polymorphism，SNP） at rs16927589 locus of miR181 gene in Guangxi population of China，and to compare the genotypes and allele frequencies of them with those of other races and regions.MethodsSNaPshot SNP and DNA sequencing were used to detect SNPs at rs16927589 loci in 299 Guangxi population of China.And statistical method was used to analyze differences of genotypes and allele frequencies between Guangxi population，HapMapHCB，HapMapJPT，HapMapLWK，HapMapGIH and HapMapCEU published by （Haplotype map，HapMap）.ResultsThere was rs16927589 polymorphism of miR181 gene in Guangxi population of China.There were three genotypes（TT，TC and CC），the frequencies of which were 73.6%， 25.4% and 1.0%，respectively，and there were two allels（T and C），the frequencies of which were 86.3% and 13.7%，respectively.Difference of genotypes and allele frequencies of rs16927589 polymorphism between men and women was statistically significant（P>0.05），difference between Guangxi population and HapMapHCB was not statistically significant（P>0.05），but that between Guangxi population，HapMapGIH，HapMapLWK，HapMapJPT and HapMapCEU was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.ConclusionRs16927589 polymorphism of miR181 gene exists in Guangxi population of China，and there are differences between varied regions and ethnic groups.The difference of SNP in varied ethnic groups and regions may be one of the important factors of different clinical manifestations and morbidity of miR181 gene related diseases.

【Key words】miR181 gene；SNP；race

microRNA（miRNA）是一类长度约为22 nt的调控性小分子，作为非编码家族的新成员之一，没有开放阅读框架，但在细胞增殖、分化、发育、代谢和应激等过程中具有多种生物学行为[1]。多数学者认为单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮（SLE）的发生存在遗传易感性，并与其表达存在相关性[2～4]。病例研究发现，primiR34b/c rs4938723 SNP显著增加了宫颈癌发病的风险[4]。miR143/145启动子区rs4705342 SNP显著降低了缺血性脑卒中的发病风险[3]。miR181通过影响T细胞、B细胞发育等在SLE发生和发展中起着至关重要的作用，如导致免疫复合物清除能力下降、细胞凋亡增加[5～7]。但至今miR181基因多态性与SLE的遗传易感性研究尚未见报道。本研究采用SNaPshot SNP分型和DNA测序技术对中国广西地区299例健康人群rs16927589多态性进行检测，其结果与HapMap公布的不同种族和地区人群的结果进行比较，分析不同地域和种族人群间rs16927589多態性的分布差异情况，为后期miR181基因参与的相关疾病防治的研究及人类群体遗传学研究提供参考资料。

1对象与方法1.1对象筛选本地来我院体检的无亲缘关系的健康人群299例，女261例，男38例，年龄24～67岁，实验室检查各项指标及临床体检均无异常，排除患有感染、心脑血管及肿瘤等疾病。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取EDTAK2抗凝管采集体检者静脉血3 ml，置于-70℃冰箱保存备用；采用人类全血DNA提取试剂盒（深圳亚能）提取样本DNA，置于-70℃冰箱保存备用。

1.2.2引物设计与合成应用生物信息学软件，根据NCBI中Genebank基因库人miR181基因的全长序列，选取包含rs16927589位点的适宜长度DNA片段，用primer 30软件设计引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。rs16927589上游引物序列为：5TAATTAGGGGCAAGGGGAGGAT3，下游引物序列为：5TATGTGGGGATATGTGGGCACT3，延伸引物为：5TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAAAGTGAAATGTGATAAGAACTGTC3。

1.2.3PCR扩增及测序对miR181基因rs16927589进行PCR扩增，总体系为20 μL，其中含1x GCI buffer（Takara）2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 20 μL，上、下游引物各1.0 μL， TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA 1.0 μL，用纯水补至20 μL体系后进行多重PCR扩增。PCR产物经2 U外切酶I（EXO I，Epicentre公司）和5 U虾碱酶（SAP，Promega公司提供）纯化后，应用SNaPshot Multiplex Kit （ABI 公司提供）进行延伸反应，最后经1 U SAP酶纯化延伸产物上样ABI3130XL电泳仪测序。测序结果用GeneMapper 4.1 （AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）分析。

1.3统计学方法用SPSS 23.0软件包分析实验结果，采用直接计数法计算基因型和等位基因的频率，用四格表χ2和行×列表χ2检验计算比较各组间基因型及等位基因频率，检验水准：α=0.05。

2结果2.1miR181基因rs16927589分型miR181基因rs16927589PCR扩增产物片段大小为167 bp，其分型结果显示，rs16927589位点存在TT、TC和CC三种基因型，频率分别为73.6%、25.4%和1.0%，等位基因T和C的频率分别为86.3%和13.7%。DNA测序证实基因型结果一致。见图1。

2.2广西人群miR181基因rs16927589多态性在不同性别的比较经χ2检验，本研究纳入人群miR181基因rs16927589基因型数据符合哈迪温伯格平衡（HardyWeinberg equilibrium，HWE）定律（P=0200），说明研究对象具有群体代表性。统计结果显示，rs16927589位点基因型和等位基因频率在广西人群男女性别间比较差异均无统计学意义（P>005）。见表1。

2.3广西地区人群miR181基因rs16927589基因型和等位基因频率与其他不同地域和种族人群的比较 广西人群miR181基因rs16927589基因型及等位基因频率与HapMapJPT、HapMapLWK、HapMapGIH及HapMapCEU人群比较差异均有统计学意义（P<0.05或0.01），但与HapMapHCB人群比较差异无统计学意义 （P>0.05）。见表2和表3。注：①、②、③箭头指向分别表示TT、TC、CC基因型

3讨论miR181基因簇由miR181a、miR181b、miR181c和miR181d组成，前两者分别位于1号和9号染色体上，后两者则位于19号染色体上。人类基因组单体型图计划研究发现，miR181基因存在多个功能性SNPs 位点，这些位点多态性改变可能会引起miR181编码活性及miR181基因相关疾病遗传易感性发生改变，最终导致miR181相关疾病的发生和发展。前期关于基因多态性与疾病的相关性研究主要集中在蛋白编码基因上[8～10]，较少涉及非编码基因。近年来，越来越多的研究表明微小RNA基因多态性与疾病的发病相关[11～13]。我们课题组前期研究发现[3]，miR143/145基因rs4705342位点多态性与缺血性脑卒中的遗传易感性相关，TT和CT基因型可显著降低缺血性脑卒中的发病风险（TC vsTT：adjusted OR=0.74，95% CI，0.57～0.97； CC vsTT：adjusted OR=0.53，95% CI，0.34～0.83）。目前关于miR181基因多态性与疾病的遗传易感性研究尚未见文献报道。基因多态性多因种族、环境、地理位置、饮食和生活习惯等不同呈现不同程度差异，而同一SNP位点在不同种族、地区人群间对疾病遗传易感性的影响也表现出很大区别[14]。例如，Geng等[15]发现IL17A基因rs2275913多态性与冠心病的发病相关，然而墨西哥学者VargasAlarcon等[16]却发现rs2275913多态性与冠心病的遗传易感性无关。由此可见，不同种族和地区人群间正常人群基因多态性研究可为我们提供这些地区人群的遗传背景资料，为其与相关疾病的遗传多态性研究提供基础理论依据和数据支持。

本研究檢测了中国广西地区正常人群miR181基因rs16927589 存在多态性的分布情况，结果显示其有TT、TC和CC三种基因型，含T和C两种等位基因，以TT基因型（73.6%）与等位基因T （86.3%）常见，两者在性别间比较差异无统计学意义，表明广西人群rs16927589无性别间差异。而与HapMap公布的不同人群SNP比较分析发现，我国广西健康人群miR181基因rs16927589基因型及等位基因频率与HapMapJPT、HapMapLWK、HapMapGIH及HapMapCEU人群比较差异均有统计学意义，与HapMapHCB人群比较差异无统计学意义。广西人群rs16927589 T和C等位基因频率为86.3%和13.7%，与HapMapJPT（T，93.6%；C，10.4%）、HapMapLWK（T，95.6%；C，4.4%）、HapMapGIH（T，98.7%；C，13%）及HapMapCEU（T，100%）相差较大，与同是亚洲人的HapMapHCB（T，89.5%；C，10.5%）相差较小，结果吻合“亲缘关系越近，基因型分布差异越小”的基因遗传定律。结果也表明，基因多态性存在民族、种族和地域差异，同时与各地地理位置、环境、气候、饮食和生活习惯相关。

综上所述，中国广西人群存在miR181基因rs16927589多态性，其基因型和等位基因频率在不同种族和不同地区人群之间比较存在不同程度的差异。对中国广西人群miR181基因rs16927589多态性研究，不仅有助于辨析miR181家族基因与其相关疾病的发生在不同种族、不同地域表现的差异，而且进一步为相关疾病防治的研究及人类群体遗传学研究提供参考资料。参考文献[1]Vidigal JA，Ventura A.The biological functions of miRNAs：lessons from in vivo studies[J].Trends Cell Biol，2015，25（3）：137147.

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（收稿日期：2018-01-25修回日期：2018-0321）

（编辑：梁明佩）