紫地榆活性成分对致龋菌生长和产酸影响的体外研究

2018-07-05王丽梅杨晓珍

大理大学学报 2018年6期

王丽梅，杨晓珍，蓝海*

（1.大理白族自治州人民医院口腔科，云南大理 671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000）

龋病是在多因素影响下的牙齿硬组织发生的慢性疾病。其中致龋菌产酸可导致羟基磷灰石晶体溶解，无机钙、磷离子移出等，因此致龋菌产酸是釉质脱矿、发生龋损的主要原因。龋病表现为无机质的脱矿和有机质的分解，病变过程是一个脱矿与再矿化交替进行的过程〔1〕。紫地榆（Geranium strictipesR.Knuth）是牻牛儿苗科老鹳草属植物，其根入药，能消积食。有文献报道，紫地榆提取物能抑制牙釉质脱矿并能促进牙釉质再矿化〔2-8〕。紫地榆的乙酸乙酯提取物和水提物均能有效抑制口腔中变形链球菌和血链球菌的生长和产酸〔9-11〕。本文旨在研究紫地榆活性成分对常驻口腔细菌的生长及产酸的影响。

1 材料

变形链球菌（批号：ATCC25175）、粘性放线菌（批号：ATCC27044）菌种购于广东微生物菌种保藏中心；TPY液体培养基购于青岛海博生物技术有限公司；没食子酸，五倍子酸甲酯，儿茶素，鞣花酸，0.05%醋酸洗必泰（chlorhexidine acetate，CA），0.5、0.1 mol∕L氢氧化钠，葡萄糖，蔗糖，0.5 mol∕L磷酸盐缓冲液（PBS），无水乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，三氯甲烷，以上试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 实验溶液的制备将紫地榆的4种活性成分溶于TPY液体培养基中，使其最终浓度为16.000 g∕L，使用时按2倍稀释法〔12〕稀释。

2.2 菌液的制备将细菌复苏48 h后接种于TPY液体培养基中于厌氧条件下（37℃，80%N2、20%CO2）培养18 h进行增菌。经鉴定为纯培养后，离心，取菌体用无菌生理盐水洗涤3次。调整2种细菌的菌悬液浓度约5×107CFU∕mL。

2.3 2种致龋菌最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）的测定配制含有紫地榆活性成分的液体培养基，按2倍稀释法调整活性成分的浓度在0.125 g∕L至16.000 g∕L。在培养皿中接种细菌，菌悬液：含活性成分的培养基=1：1（V∕V），厌氧培养48 h。结果以肉眼观察无菌生长的紫地榆活性成分浓度确定为该活性成分对该细菌的最低抑菌浓度。选择大于最低抑菌浓度的各孔，取20 μL涂布于固体培养基上，肉眼观察菌落数少于5～6个的紫地榆活性成分浓度为最低杀菌浓度。

2.4 紫地榆活性成分对2种口腔常驻细菌产酸能力影响的测定根据“2.3”项下的测定结果，将含活性成分的液体培养基配成最低抑菌浓度以下4个浓度梯度，阳性对照组为0.05%醋酸洗必泰，阴性对照组为不含药物的空白组，共6组，每组设3个平行管。将初始pH值调为7.4，菌悬液：含活性成分的培养基=1：1（V∕V），厌氧培养48 h。用pH计测定上清液的pH值并计算其pH的变化值△pH〔13-14〕。

2.5 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，数据以（）表示，采用单因素方差分析比较各组总体均数，用Dunnett T3检验进行数据间两两比较，α=0.05。

3 结果

3.1 紫地榆活性成分对2种口腔常驻细菌生长的影响从表1可以看出，紫地榆活性成分对变形链球菌和粘性放线菌均有生长抑制和杀菌作用。

表1 紫地榆活性成分对2种口腔常驻细菌的MIC和MBC值（g∕L）

3.2 紫地榆活性成分对2种口腔常驻细菌产酸作用的影响由表2可见各浓度实验组与空白对照组相比均具有抑制产酸的作用，差异均具有统计学意义（P＜0.05），并且随着浓度升高，其抑制产酸作用逐渐增强；1∕2MIC儿茶素组对变形链球菌和粘性放线菌的产酸抑制效果与阳性对照组相近，差异无统计学意义（P＞0.05）；其余实验组的产酸抑制效果均不如阳性对照组（P＜0.05）；不同浓度的同一实验组比，组间差异均具有统计学意义（P＜0.05），其抑制产酸作用都随浓度的增加而加强；1∕2MIC没食子酸与1∕4MIC鞣花酸对变形链球菌产酸的抑制效果相同（△pH=0.84）；1∕16MIC没食子酸、1∕16MIC五倍子酸甲酯和1∕16MIC鞣花酸对变形链球菌和粘性放线菌的抗酸效果差异无统计学意义（P＞0.05）；总体来说，儿茶素对变形链球菌和粘性放线菌的抗酸效果优于其余各实验组。

表2 紫地榆活性成分对变形链球菌和粘性放线菌产酸的影响（，n=6）

注：a.与阴性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；b.与阳性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；c.任意两实验组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

组别浓度∕(g∕L)变形链球菌ΔpH 粘性放线菌ΔpH阴性对照组阳性对照组2.5900±0.0483 0.4400±0.0354 0.9600±0.0248abc 1.1700±0.0539ab 2.1900±0.0472ab 2.4000±0.0703ab 0.8300±0.0339ab 1.5900±0.0496abc 2.1700±0.0845ab 2.4500±0.0593ab 0.5000±0.0418ac 1.1900±0.0616ab 1.9300±0.0573abc 2.2500±0.0573abc 0.8000±0.0358ab 1.4900±0.0407abc 2.2000±0.0757ab 2.4100±0.0631ab没食子酸■■■五倍子酸甲酯■■■■■■■■■儿茶素■■■■■■■■■鞣花酸■■■■■■■■■■■■■■■12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 2.6700±0.0306 0.5500±0.0323 0.8400±0.0323ab 1.1000±0.0524abc 2.1500±0.0451ab 2.4600±0.0303ab 0.7000±0.0417ab 1.0200±0.0546abc 2.1300±0.0585ab 2.4000±0.0868abc 0.5200±0.0392ac 1.2000±0.0582abc 1.7200±0.0615abc 2.5000±0.0562abc 0.6800±0.0290ab 0.8400±0.0483ab 2.0900±0.0561ab 2.3100±0.0509ab