不同演替阶段核桃根际放线菌群落生态特征

王传琪，肖 文，严丽红，马 瑞 ，杨晓燕*

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理 671000；2.大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理 671003；3.大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003）

根际是植物自身创造的一种特殊环境，由植物根系包围，并受植物根系的影响，是大量微生物和无脊椎动物的家园，被认为是地球上最具活力的界面之一〔1〕。而在其中生存的微生物被定义为根际微生物，是根际微生物生态系统中的重要组成部分，主要包括细菌、真菌和放线菌三大群落〔2〕，它们在转化土壤有机质时，能够释放矿物质，进而对植物的原生演替产生促进作用，反过来，植物以腐殖质和根系分泌物的形式向土壤子系统补充能量，大大促进了微生物活动，使得根际土壤微生物数量远远高于非根际土壤〔3-4〕。目前，越来越多的研究表明，土壤微生物对于植物的生长和健康具有重要影响，但是，植物在生长和发育过程中对微生物群落结构和生态功能的反作用尚无定论〔5〕。2015年，Guo等〔6〕采用磷脂脂肪酸分析法对海南橡胶园橡胶根际土壤和非根际土壤微生物群落的空间变化进行了研究，通过对不同树龄橡胶树根际微生物群落结构的分析研究表明，根际土壤中的总生物量明显高于非根际土壤，并且随着树龄的增加，土壤微生物生物量呈逐渐上升趋势。但2007年，王韵等〔7〕对广西喀斯特地区不同演替阶段植物根际微生物群落的研究表明，在植被恢复过程中，随着树龄的增加，细菌和土壤微生物总量逐渐增加，真菌则逐渐减少。为了进一步探究植物在生长和发育过程中对微生物群落结构和生态功能的影响，本研究以核桃根际放线菌为研究对象，结合其抑菌活性开展研究，了解不同演替阶段核桃根际放线菌群落结构特征和生态功能特征的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品采集 样品采自漾濞县苍山西镇光明村（东经99°58′6.816″，北纬25°40′3.216″）10棵不同树龄核桃根际土壤，每棵核桃树之间平均相距约700 m，取样部位为树冠投影内缘，离树干1.0 m左右，按“东南西北”4个方位，采集土样，采集时除去核桃根部表层土壤，取5～15 cm土层的土壤约200 g，装入封口样品袋混匀。核桃树龄通过走访当地居民确定，分别为 10、20、30、40、50、100、200、260、350、500年，所有采集的样品置4℃冰箱保存，1周内处理完所有样品。

1.1.2 供试病原菌 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，批号：ATCC186335）、大肠杆菌（Escherichia coli，批号：ATCC25922）、青霉菌（Penicillium，批号：ATCC117714），供试病原菌由大理大学农学与生物科学学院微生物实验室提供。

1.1.3 培养基 高氏一号培养基、PDA培养基、发酵培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的配制方法见文

献〔8-9〕。

1.2 方法

1.2.1 放线菌的分离 将土样取出，置于室内风干，充分研磨，过筛，然后分别称取10 g土壤转置于盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，置于45℃恒温摇床中120 r∕min振荡24 h，使蕴藏在样品中的放线菌充分释放〔10〕，温室中静置20 min备用。采用10倍比稀释法将土样悬液稀释为10-3、10-4、10-5，分别吸取0.1 mL土壤悬液涂布到高氏一号培养基上，每个浓度设置3个平行，置于28℃恒温箱中倒置培养4～7 d。挑取单菌落进行平板划线分离培养，经过多次纯化接种到高氏一号斜面培养基，并置于28℃恒温箱中培养24 h，然后于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 菌株鉴定 根据国际链霉菌计划（ISP）中有关放线菌培养特征的标准，观察并记录放线菌在不同培养基上的生长情况〔11〕。采用插片法〔12〕观察自然状态下基丝、气丝、孢子丝、孢子的形态，并用微分干涉显微镜AE31进行拍照，参照《放线菌快速鉴定与系统分类》鉴定到属。

1.2.3 抑菌活性的测定 病原菌菌悬液制备：将冷冻保存的金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）划线接种至牛肉膏蛋白胨培养基上，青霉菌（Penicillium）划线接种至PDA培养基上，37℃培养24 h；挑取单菌落至装有10 mL无菌PBS缓冲液的试管中，得到病原菌菌悬液，置于4℃冰箱中备用〔13〕。

放线菌发酵液制备：菌种经斜面活化后，用接种环将菌落接种于发酵培养基，28℃、160 r∕min摇床培养 6 d，发酵结束后，8 000 r∕min 离心，取上清，-20℃保存备用。

抑菌圈直径测定：采用滤纸片法〔14〕进行测定。分别取金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.coli）菌悬液100 uL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，青霉菌（Penicillium）菌悬液100 uL涂布于PDA培养基。取20 uL发酵液滴加于6 mm无菌滤纸片，将其分别贴于上述培养基上，细菌和青霉菌分别置于30℃恒温箱中培养24 h和48 h后观察有无抑菌圈，并测量抑菌圈直径。

1.2.4 数据分析 将采样点土壤样品按照树龄分为两组，树龄＜100年的采样点为演替早期，树龄≥100年的采样点为演替后期，使用SPSS 17.0对数据进行两组独立样本双侧t检验。

2 结果

2.1 放线菌分离纯化结果 本研究共分离得到133株放线菌，初步鉴定为11个属，演替早期采样点共分离到83株放线菌，分布于10个属，演替后期采样点共分离到50株放线菌，分布于6个属（表1）。其中链霉菌属（Streptomyces）和间孢囊菌属（Intra⁃sporangium）分布较为广泛，在所有采样点中均能分离到，原小单孢菌属（Promicromonospora）、糖丝菌属（Saccharopolyspora）和小双孢菌属（Microbispora）仅在一个采样点分离到。

如表2所示，从演替早期土壤样品中分离的放线菌属丰富度高于演替后期（t=2.921，P=0.019），检出率亦然（t=5.127，P=0.001）。

2.2 不同演替阶段抑菌活性菌株分布 如表3所示，从演替后期土壤样品中分离到的活性菌株数量高于演替早期（t大肠杆菌=-2.479，P=0.038；t金黄色葡萄球菌=-2.613，P=0.031；t青霉菌=-2.399，P=0.043）。

表1 不同演替阶段核桃根际放线菌检出数量

表2 不同演替阶段属丰富度和检出率的差异

表3 不同演替阶段抑菌活性菌株数量

2.3 不同演替阶段菌株抑菌活性特征 如表4所示，从演替后期土壤样品中分离到的活性菌株抑菌活性与演替早期差异无统计学意义（t大肠杆菌=-0.396，P=0.695；t金黄色葡萄球菌=0.331，P=0.743；t青霉菌=-0.225，P=0.823）。

表4 不同演替阶段菌株抑菌活性

3 讨论

本研究在核桃根际共分离到放线菌133株，演替早期核桃根际土壤中放线菌资源较演替后期核桃根际中多，与崔翠〔15〕研究结果基本一致，即在不同生长年限的核桃根际土壤中，土壤微生物数量及种群发生了较大的变化，放线菌种群数量随着生长年限的增长而呈现降低的趋势，这可能由于生态系统发育早期阶段根系生长迅速，有助于释放多种关键营养物质，使土壤有机质不断积累，为微生物的生长创造了良好的生长环境〔16〕，这种生态系统的早期转变是基本的，通常是由植物与共生细菌之间早期的互惠关系驱动的〔17-18〕，然而，由于土壤有机质的长期损失和根系重新分配关键营养物质，植物和根际微生物相互拮抗，物种之间对于资源的竞争加剧，最终限制了生态系统的生产力〔19〕，导致微生物数量不断减少。植物根际土壤微环境随着植物生长而不断变化，根际微生物为适应微环境的改变而发生群落结构的演替。

在演替过程中，随着放线菌群落结构的不断变化，具有抑菌活性的放线菌数量和所抑制病原菌的种类也在不断变化，演替后期分离得到的放线菌的数量明显高于演替早中期，并且在不同演替阶段对不同病原菌的抑制能力也不相同，这可能与植物—根系—微生物的相互作用有关。根际是受植物根系活动影响、靠近植物根系的微域土区，直接受到植物的影响〔20〕，是微生物相互作用、基因交换和群落结构演替的关键区域〔21〕。研究表明，植物可以通过自身合成或从外部环境中吸收物质，分泌到根际周围的土壤中，通过微生物之间的竞争作用，对根际微生物群落结构进行选择性塑造〔22〕，例如链霉菌能够分泌嗜铁螯合铁离子〔23〕，从而可以利用较多的铁离子，限制土壤其他微生物的生长。并且，根际微生物在与宿主植物的长期进化过程中，与次级代谢产物生物合成有关基因可通过水平基因转移使得植物根际放线菌产生一些由植物合成的生物活性物质〔24-25〕。而核桃的有效成分大多存在于植物根部，其根际微生物长期以来受根系分泌物的影响，使得核桃根际微生物群落结构和功能特征存在一定特殊性〔26〕。

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