盐酸戊乙奎醚、右美托咪定对大鼠急性肺损伤的保护作用

孟志鹏，刘静，胡四平，童飞，龚浩杰

内毒素（LPS）导致的脓毒血症是全身炎症反应综合症，肺脏是脓毒症时最先受到攻击的靶器官，发生率高达83%～100%，可引起急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）甚至多器官功能障碍综合征（MODS）[1]。目前ALI的研究证明炎性反应失衡是ALI的根本原因之一，临床最基本的治疗方法也以控制感染为主，抗感染治疗和脏器保护方面都已经取得巨大的进步，但迄今为止ALI/ARDS病死率仍高达30%～40%[2]。右美托咪定（DEX）是一种高选择性-2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、镇痛、催眠又不抑制呼吸等特殊优势，特别是在脓毒症患者急性肺损伤呼吸机支持治疗时[3]。DEX还具有独特的抗炎、抗氧化和肺保护作用[4-5]，能减轻呼吸机相关性肺损伤[6]。盐酸戊乙奎醚（PHC）是新型莨菪碱类抗胆碱药[7]，国内已有研究表明盐酸戊乙奎醚作用于M1、M3受体，降低胆碱能神经的张力，使支气管平滑肌松弛，支气管扩张，减少分泌物，降低气道阻力和增加呼吸流量，改善气道压力，增加肺顺应性减缓急性肺损伤的进展[8-9]，对各种类型的肺损伤具有一定的保护作用。本研究旨在比较PHC及DEX对LPS致大鼠ALI的保护性作用，以期为临床ALI的治疗提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 成年清洁健康雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量250～300g，由浙江省医学科学院动物实验中心提供 [动物使用许可证号：SYXK(浙)2014-0001]，于室温22～24℃、分组分笼安静环境下适应性喂养，每笼 3～4只，模拟昼夜交替12 h，可自由饮食饮水，适应环境1周。

1.2 模型制备与分组 大鼠禁食12 h，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg麻醉后称重，仰卧位固定于垫有保温毯的操作台上，待其体痛反射消失后用0.7 mm穿刺针（苏州BD医疗器械公司）行右股静脉、右颈内动脉置管。大鼠术中自主呼吸保留。按随机数字表法将大鼠分为4组，每组10只：0.9%氯化钠注射液组（对照组），经右股静脉给予等量0.9%氯化钠注射液；LPS处理组（LPS组），右股静脉按6mg/kg注射LPS（美国Sigma公司）；DEX治疗组（L+D组），右股静脉注射等量LPS0.5h后2min内同样通过右股静脉注射DEX 50g/kg（江苏恒瑞医药公司，批号：16060132），随后以 5g·kg－1·h－1微量注射泵泵入；PHC治疗组（L+P组），右股静脉注射等量LPS 0.5 h后2 min内同样通过右股静脉注射PHC1mg/kg（成都力思特制药股份有限公司，批号：H20080606），随后以1g·kg－1·h－1微量注射泵泵入。

1.3 标本采集与检测 大鼠注射0.9%氯化钠注射液或LPS 6 h后实验结束，右颈动脉采血2 ml后放血处死，血液经肝素抗凝后，4℃下以2 000 r/min离心10 min，离心半径为13.5 cm，用酶联免疫吸附（ELISA）法测定肿瘤坏死因子-（TNF-）水平，试剂盒购自杭州联科生物公司（批号：70-EK3822/2）；测定包细胞介素-1（IL-1）、包细胞介素-6（IL-6）含量，试剂盒购自杭州联科生物公司（批号：70-EK3062/2）。胸部备皮消毒后置于无菌操作台上,严格无菌操作，依解剖结构打开胸腔，充分暴露心脏，经右心室插管至肺动脉，用0.9%氯化钠注射液快速冲洗后取右肺上叶4mm×4mm组织，将其置于4℃4%甲醛溶液固定48 h，石蜡包埋，切片（厚度5m），HE染色，光镜下行肺组织病理学检查，并从中性粒细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡腔内出血及肺泡腔渗出四方面按严重程度行弥漫性肺泡损伤标准（DAD）评分（正常：0分；轻度：1分；中度：2分；重度：3分）[10]；取右肺中叶组织，滤纸吸尽表面水分，用电子分析天平称湿重（W），然后置80℃电热干燥箱内烘烤24 h左右，待质量恒定后称干重（D），计算肺组织湿/干重比值（W/D）。分离气管，夹闭右支气管，分3次用4℃0.9%氯化钠注射液按20ml/kg行左支气管肺泡灌洗，并回收左支气管肺泡灌洗液（BALF），并于4℃下以1 200 r/min离心10 min，离心半径为13.5 cm，用ELISA法测定BALF的TNF-、IL-6含量，用蛋白定量法（BCA）测定总蛋白含量（TP），试剂盒购自碧云天生物研究所（批号：P0012）。

1.4 统计方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，采用 检验；计数资料采用2检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

组血浆TNF-、IL-1及IL-6均高于对照组（19.3，均＜0.05）；L+D组、L+P组血浆TNF-、IL-1、IL-6均低于ALI组（22.3，均P＜ 0.05）；L+P 组与L+D组差异无统计学意义（=0.05＞ 0.05）。见表1。

2.2 病理学观察 光镜下，对照组无明显肺损伤，结构未见明显异常，中性粒细胞浸润少见；ALI组肺泡结构破坏严重，结构紊乱，大量中性粒细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔渗出伴有明显出血；L+D组、D+L组组也有肺损伤，但较LPS组轻，肺泡结构破坏、间质中性粒细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡腔渗出、出血程度均较LPS组轻；D+L组各项指标较L+D组程度轻。见封四彩图3。

2.3 DAD评分和W/D比较 3个实验组DAD评分均高于对照组（13.598，均＜0.05）；L+D组与L+P组DAD评分均低于ALI组（≥50.596，均＜0.05）；L+P组与L+D组差异无统计学意义（=0.17，＞ 0.05）。3个实验组 W/D均高于对照组（28.461，均＜0.05）；L+D组、L+P组W/D均低于ALI组（8.433，均＜0.05）；L+P组与L+D组差异无统计学（=0.88＞0.05）。见表2。

3 讨论

LPS作用于肺内的内皮细胞、上皮细胞和巨噬细胞等，激活IL、TNF-和其他炎症介质大量表达，促使中性粒细胞在肺组织内活化和聚集，产生大量氧自由基，引起肺毛细血管内皮损伤，完整性破坏，毛细血管屏障受损、渗漏，血管通透性增加，富含蛋白的液体渗入到肺泡腔，促使肺组织炎性渗出和肺泡损伤[11-12]。该试验选择股静脉注射6mg/kg LPS制备大鼠ALI模型，出现特征性肺组织病理学改变，与对照组比较，实验组大鼠病理学切片示肺组织损伤、大量中性粒细胞浸润、肺泡腔内渗出、出血、肺泡间隔增宽，肺W/D值升高，DAD评分升高，表明成功制备了大鼠ALI模型。

表1 各组血清TNF-和IL-6水平比较 pg/ml

表2 各组DAD评分和肺组织W/D值比较

表3 各组肺泡灌洗液中TNF-、IL-6和TP比较

DEX是一种新型高选择性-2肾上腺素受体激动剂，与-2受体结合后具有镇痛、镇静、催眠、不抑制呼吸等优点在临床得到广泛使用[13]；PHC是一种新型抗胆碱药，其抗胆碱能作用可减少腺体分泌和气道阻力，增加肺顺应性，缓肺毛细血管和支气管平滑肌痉挛，改善局部微循环、减轻水肿，改善肺功能。还能稳定细胞膜及溶酶体、线粒体等细胞器的膜结构，抑制 TNF-、IL-6等促炎因子释放，减轻炎症反应[14-15]。

TNF-是应激反应中起核心作用的最早促炎因子，是ALI发生发展的始动因素，是引起ALI最重要细胞因子之一，且与IL-1、IL-6具有协同作用，促进ALI发展。本研究静脉注射LPS后，血清和BALF中上述炎症因子的浓度都升高，提示LPS诱发大量炎症因子生成和释放，炎症反应失控，体内的促炎和抗炎的动态平衡被打破，而肺组织是其攻击的首要器官。给予DEX或PHC处理后，血清和BALF中炎症因子浓度降低，且DEX或PHC治疗效果无明显差异，与对照组无差别水平，提示DEX或PHC可以抑制LPS致大鼠脓毒症引起的炎症因子的释放，减轻LPS导致的肺组织炎性反应。本研究结果还表明，大鼠ALI模型成功制备后，病理切片提示肺组织一定程度的损伤，肺组织DAD评分、W/D值及BALF中的总蛋白升高，给予DEX或PHC处理后，病理切片提示肺组织损伤情况较LPS模型有明显改善，肺组织DAD评分、W/D值及BALF总蛋白显著下降，表明DEX或PHC治疗可以降低肺泡水肿的程度，对ALI具有一定的保护作用，且DEX或PHC治疗效果无明显差异。

综上所述，DEX和PHC都可以对LPS致大鼠ALI有保护作用，且效果相当。由于内毒素致大鼠急性肺损伤发生机制尚未研究透彻，DEX或PHC对急性肺损伤详细的保护作用机制、给予不同时机、不同剂量的效果仍需进一步研究。

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