长链非编码RNA AFAP1-AS1促进结肠癌细胞侵袭的作用和机制

李翔，史志霞，李先鹏，许丰，金永军

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来发病率和病死率呈上升趋势[1-2]。目前治疗以手术切除、放化疗和生物治疗等综合治疗为主，但预后比较差，术后5年生存率50%[3-4]。结肠癌的发生、发展和转移受到表观遗传、DNA损伤修复及癌基因表达调控等多水平多层次的复杂调控。从基因水平研究结肠癌的发病和转移机制，探索靶向治疗药物，是提高结肠癌患者生存和预后的重要途径。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类新近发现的细胞内源性的RNA分子，其转录本长度超过200nt，通过基因印记、染色质重塑、剪接调控及mRNA降解和翻译调控等多种作用方式在不同水平进行基因表达调控，参与病理生理过程的调节[5]。AFAP1-AS1位于人的 4号染色体肌动蛋白丝相关蛋白 1（AFAP1）基因反义链上，全长6 810 bp。研究显示AFAP1-AS1的表达水平与消化系统肿瘤（胆囊癌、食管癌、结直肠癌等）的发展和转移密切相关，可能参与其发病过程，但其调控机制尚未阐明[6-8]。本研究拟探索 AFAP1-AS1对结肠癌细胞侵袭的调控作用及其分子机制，为结肠癌的诊治方向提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取杭州市红十字会医院2012年1—12月手术切除并经病理学诊断为结肠癌的组织标本56例，同时选取癌旁组织36例（距离肿瘤组织1.5 cm以上），作为对照组。收集所有结肠癌患者的临床及病理资料，病理学分级及临床分期参照WHO分级标准。所有患者术前均未接受放化疗，术后随访截止于2016年12月，失访1例。

1.2 试剂 结肠癌细胞系为本科室冻存细胞株。胎牛血清、细胞培养液、胰酶和抗生素为美国Gibco公司产品；Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品；逆转录试剂盒和定量PCR试剂均为日本Takara公司产品。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 将液氮冻存的结肠癌组织块（约100 g）置于1ml trizol试剂中，匀浆后12000r/min离心5 min；将上清液转移至新的离心管中，加入200l的氯仿，剧烈震荡后静置5 min；4℃，12000r/min离心15min；吸取500l上清液后加入等体积异丙醇；混匀后于－20℃静置2 h；4℃，12 000转/min离心15min；弃上清，加入500l预冷的75%乙醇清洗沉淀；加入50l去酶水溶解后在紫外分光光度计下检测RNA质量。

1.3.2 逆转录反应 以提取总RNA为模板进行逆转录反应，合成cDNA。反应体系（10l）为 RNA（100 ng/l）2l；5×Prime Script Buffer 2l；Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5l；Random 6 mer（s100mol/L）0.5l；Oligo dT Prime（r50mol/L）0.5l；除酶去离子水，4.5l。反应程序为 37℃，15 min；85℃，5 s。逆转录反应在PCR仪（BioRad公司）完成。

1.3.3 实时定量PCR 将适当稀释后的cDNA作为模板进行实时定量PCR反应，检测基因相对表达变化。反应体系为RT反应液（5倍稀释）2l；2×SYBRPremix Ex Taq II10l；PCRForward Prime（r10mol/L）0.8l；PCRReverse Prime（r10mol/L）0.8l；灭菌去离子水6l。反应程序为 95℃，5s；60℃，30 s，设置 40 个循环，PCR反应在定量PCR仪（Roche公司）完成；以软件系统设定阈值获取Ct值，并通过公式2-△Ct分析相对表达水平。AFAP1-AS1引物序列为：F(5’-3’)：AGCCTTGGTGAGCAATAGGT；R(5’-3’)：GGTATGAAGGGTGTGGGTGA。AFAP1引物序列为：F(5’-3’)：CGTCCAGAGCAAGGAACAG；R(5’-3’)：GGCCACTACAACCACTGTAGG。 -actin引物序列为：F(5’-3’)：TGGCATCCACGAAACTACCT；R(5’-3’)：CGTACAGGTCTTTGCGGATG。

1.3.4 细胞侵袭实验 在transwell上室中铺上Martrige（l25g），下室中加有含血清趋化剂的培养液。将重悬的结肠癌细胞加入上室，置于细胞培养箱中培养24h；用棉签拭去上室上表面细胞，乙醇固定后经HE染色，光镜下观察穿过Martrigel的细胞数。

1.3.5 蛋白质免疫印迹实验 将结肠癌细胞用裂解液于冰上裂解30 min。离心5 min去除细胞碎片，收集上清液用BCA法测量蛋白浓度；取30g蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸10min使蛋白变性，进行10%SDS-PAGE电泳并将蛋白转移到硝酸纤维素膜上；室温下用5%脱脂奶粉封闭1h，随后加入一抗（AFAP1，1∶1 000；-actin，1∶2 000），4℃孵育过夜；次日冲洗后与HRP标记的二抗（1∶1 000）室温孵育1 h。按 ECL法进行显影，收集、通过Image J软件分析灰度值。

1.4 统计方法 采用SPSS22.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用student-检验；计数资料采用2检验；Kaplan-Meier法和Logrank检验法进行生存分析检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AFAP1-AS1表达与临床病理和预后生存期的分析 AFAP1-AS1在结肠癌组织中的表达高于癌旁组织（＜0.01）（封三彩图4A）；AFAP1-AS1的表达与患者年龄、性别和肿瘤分化均无相关性（均＞0.05），而与淋巴结转移、临床分期相关（均＜0.05），见表1；AFAP1-AS1高表达的结肠癌患者总生存期和无瘤生存率均低于低表达患者（均＜0.05）（封三彩图 4B）。

2.2 AFAP1-AS1重组腺病毒的构建和过表达效率鉴定 荧光显微镜观察显示，感染AFAP1-AS1重组腺病毒48 h后，85%以上的SW480细胞均显示绿色荧光；实时定量PCR结果显示，结肠癌细胞APAFAS1的表达明显升高（＜0.01）。封三彩图5。

2.3 AFAP1-AS1对结肠癌细胞侵袭的作用AFAP1-AS1在不同结肠癌细胞系中的表达水平不尽相同，SW620、LoVo和HTC116细胞系中AFAP1-AS1的表达明显高于SW480细胞系（＜ 0.01）；过表达 AFAP1-AS1的结肠癌细胞穿膜细胞数明显增多。封四彩图1。

2.4 AFAP1-AS1对AFAP1mRNA稳定性的调节过表达 AFAP1-AS1显著降低AFAP1 mRNA的水平；AFAP1-AS1与AFAP1 mRNA存在3个区域的互补，片段大小分别为191 bp、165 bp和115 bp，这些可能是维持AFAP1 mRNA稳定性的重要区域。封四彩图1。

3 讨论

结肠癌是由肠黏膜上皮发生、易发生转移的恶性肿瘤，早期诊断困难，术后复发率高。结肠癌的发病和转移是与多因素相关的复杂过程，可能与生活方式、遗传、炎症等因素有关，但具体机制尚未明确[9-10]。研究表明结肠癌的发生主要涉及一系列原癌基因的异常激活以及抑癌基因的突变等，从而引起信号通路发生传导异常[11]。

LncRNA是长度＞ 200个核苷酸的非编码RNA，在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中具有重要作用，是目前遗传学研究的热点[12]。LncRNA一般具有mRNA样结构，转录后可能有不同的剪接方式。大多数lncRNA在细胞分化、组织发育和肿瘤发生等过程中具有时空表达的特异性[13]。LncRNA在序列上保守性较低，人属中仅有约12%的lncRNA可在其它物种中发现[14]。相较于其他非编码RNA，lncRNA的作用方式更为广泛，在表观遗传、转录水平、翻译水平都具有调节作用，提示其在机体生命活动调节中的重要地位。LncRNA与编码基因的染色体位置关系，可能与其功能和机制存在密切联系。AFAP1-AS1位于AFAP1基因的反义链，与其有大比例的互补序列，推测其可能与AFAP1基因稳定性有关。生物信息学分析发现AFAP1-AS1与AFAP1mRNA存在3个区域的互补，这些可能是维持AFAP1mRNA稳定性的关键序列。

近期研究发现AFAP1-AS1的表达水平与胃癌、胆管癌、卵巢癌等多种肿瘤的生长和转移密切相关。Wu等[15]首先在食管腺癌组织中发现AFAP1-AS1由于低甲基化而高表达，随后发现AFAP1-AS1的高表达与鼻咽癌、非小细胞肺癌和胰腺癌的预后差密切相关[16-18]。Han等[8]在结直肠癌组织和HCT116和SW480细胞系中发现AFAP1-AS1高表达。本研究AFAP1-AS1在SW620、LoVo和HTC116细胞系中的表达明显高于SW480细胞系，这可能与各细胞系的生物学功能（增殖、侵袭能力等）有关。

表1 结肠癌组织中AFAP1-AS1表达与临床病理资料的关系 例

AFAP1作为肌动蛋白与其它蛋白的连接分子，可被PKC磷酸化而激活，并活化Src蛋白，从而导致肌动蛋白纤维完整性的改变，影响细胞的吞噬、运动及肿瘤的侵袭和转移[19-20]。AFAP1-AS1作为其反义链上的lncRNA，可能通过AFAP1表达参与生理病理进程的调控。Han等[8]发现敲低AFAP1-AS1明显抑制肿瘤转移相关基因的表达和结直肠癌的肝转移进程。本研究显示AFAP1-AS1过表达后，SW480细胞侵袭能力明显增加；预后Kaplan-Meier曲线分析显示，AFAP1-AS1高表达的结肠癌患者总生存期和无瘤生存率显著少于低表达患者。这些结果说明AFAP1-AS1可能是抑制结肠癌转移的潜在靶点。

综上所述，本研究从临床水平发现AFAP1-AS1表达水平与结肠癌预后的相关性；细胞水平发现AFAP1-AS1提高结肠癌细胞侵袭能力的作用，分子水平明确AFAP1-AS1对AFAP1mRNA稳定性及蛋白表达的调节作用。结果提示 AFAP1-AS1的表达水平与结肠癌发生、发展和转移密切相关，可能成为结肠癌治疗的潜在靶点，深入探索其调控机制将为结肠癌靶向治疗研究提供新的方向。

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