猪毛尾线虫的检测及其ITS序列分析

郭楠楠，张帆帆，唐玉新,张 敏，吴家斌，吴 琼，叶 昱*，宋德平*

(1.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045；2.江西省畜禽疫病诊断和防控重点实验室，江西南昌 330045)

毛尾线虫俗称鞭虫，属于无尾感器纲(Aphasmidea)、毛尾目(Trichurata)、毛尾科(Trichuridae)、毛尾属(Trichuris)，寄生在人体和动物肠道，可引起人畜共患的寄生虫病。猪毛尾线虫(T.suis)又称猪鞭虫，寄生于猪盲肠和结肠内，是导致仔猪和育肥猪腹泻的常见猪寄生虫。猪毛尾线虫虫体呈乳白色，虫体前段细长，呈丝状，后部粗短；是一种具有直接型生活史的蠕虫，在流行病学上被称为土源性蠕虫，可在土壤中存活5年，且感染能力较强[1]。哺乳及保育、育肥猪等易感，主要是通过食入被感染性虫卵污染的饮水或者饲料而感染。被食入的感染性虫卵到达小肠后，幼虫从虫卵中逸出，进入小肠绒毛，经过一段时间的发育后逐渐移行至盲肠和结肠内，且可在肠系膜上固着并发育为成虫。仔猪和育肥猪感染后主要表现为间歇性或顽固性腹泻，粪便中可见黏液或血液；随着病程发展，猪只食欲不振、被毛粗乱、消瘦，进而引起死亡或其他疾病，如链球菌病、支原体肺炎等。该病发病率可达20%～60%，传播迅速，死亡率较高，而且偶尔也会感染人[2]，是危害猪群和人类的重要公共卫生疾病。病猪主要在肠道、肝脏和肺脏等部位发生病理变化，表现为盲肠和结肠内充满虫体，肠系膜胶冻样，肝脏出现灰白色寄生虫结节包囊[2]。目前对该病的诊断方法主要有虫体、虫卵观察法和分子生物学诊断方法等，前者主要通过形态学比较进行诊断，但是对形态相近的虫体、虫卵以及幼虫，形态学鉴定具有一定的局限性[3]；后者可在分子水平上进行诊断，通过扩增种内高度保守性的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列[4]并与数据库比对，可实现对该虫的快速检测。

2015年11月，江西某猪场3月龄～5月龄育肥猪出现顽固性腹泻，且腹泻粪便可见黏液，有约10%的猪只出现便血；随后发病猪只出现消瘦、苍白、精神不振等症状，大约5%的发病猪只死亡。通过对典型发病死亡病例的剖检，发现盲肠和结肠内容物恶臭，且肠道内存在大量乳白色的线状虫体；利用饱和盐水漂浮法从肠道内容物中检出大量该虫虫卵，结合成虫与虫卵的形态，初步判断该线虫为猪毛尾线虫。为了对分离的线虫进行进一步的种属鉴定，本研究通过针对寄生虫ITS序列的通用引物，经过PCR扩增ITS片段并测序，鉴定该线虫的种类，为进一步开展分子遗传学和诊断研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 将江西某猪场发病育肥猪部分肠道收集后分装并分别置于4℃和-20℃保存，虫体从发病猪肠道内分离，并用福尔马林溶液保存备用。

1.1.2 主要试剂 蛋白酶K、10×buffer、dNTP Mixture、DNA聚合酶(rTaq)、DNA Marker DL-2000、pMD18-T载体、DNA胶回收试剂盒等为宝生物工程(大连)有限公司产品；TOP 10感受态细胞为北京天根生化科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 显微镜检查 挑取约1 g肠道内容物于装有少量饱和氯化钠溶液的100 mL锥形瓶中，搅拌均匀，续加饱和氯化钠溶液至瓶口形成凸面，静置15 min，载玻片中央触及凸面迅速翻转，置显微镜(100×)下观察虫卵并拍照。

1.2.2 虫体DNA的提取 参照万新龙[5]、何旭锋[6]和付美英[7]等对不同线虫DNA的提取，进行虫体DNA的抽提。具体方法如下：挑取1～2条供试虫体放入200 μL的EP管中，向EP管中加入16 μL ddH2O和2 μL 10×buffer，置于-80℃ 4 h；从-80℃取出EP管放入85℃水浴锅中温浴2 min，取出后加入2 μL 蛋白酶K，56℃水浴保温3 h，95℃条件下将蛋白酶K灭活10 min，最后将EP管放入离心机10 000 r/min离心2 min，取上清；将提取的虫体DNA置-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增 该引物参考彭仕明等[8]针对线虫ITS基因的保守序列设计，其核苷酸序列组成如下：上游引物为：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，下游引物为：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。

PCR扩增反应体系为：2.5 μL DNA模板，1 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL10×PCR buffer，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，0.3 μL rTaq(5U/μL)，加入ddH2O至25 μL。反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，36个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物经含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶成像系统拍摄记录结果。

1.2.4 扩增片段的克隆、筛选及测序 在紫外灯下将目的条带切下，用DNA胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，纯化之后将其与pMD18-T载体4℃过夜连接，后将产物转入TOP10感受态细胞中，在LB平板(Amp+)涂板过夜培养，挑取单一菌落摇菌扩增后进行菌液PCR检测，筛选阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.5 猪毛尾线虫ITS核苷酸同源性及进化树分析 将测序结果录入NCBI进行比对，根据BLAST结果初步判断其种类。参照GenBank中的18条毛尾线虫ITS基因序列，利用DNAStar 7.10和MEGA 6.0软件进行分析核苷酸序列的同源性，并绘制系统发育进化树。

2 结果

2.1 虫卵检查结果

利用饱和氯化钠漂浮法，在光学显微镜下可观察到新鲜虫卵呈棕黄色，形似腰鼓，两端有塞，且卵壳较厚，大小约为(52～61)μm×(27～30)μm(图1)。根据虫卵形态初步确定为猪毛尾线虫卵。

图1 猪毛尾线虫卵(100×)

2.2 虫体ITS序列扩增与测序

提取的虫体DNA经PCR扩增，可见一条约1 345 bp的特异性片段(图2)。序列测定结果与GenBank中登录的序列进行Blast比对，发现该序列与猪毛尾线虫参考序列的同源性高达99.8%，进一步确定该线虫为猪毛尾线虫。

M.DNA 标准DL 2 000; 1.PCR产物; 2.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR product; 2.Negative control

图2猪毛尾线虫DNA ITS片段的PCR扩增结果

Fig.2 PCR results of ITS gene ofTrichurissuis

2.3 ITS序列系统发育进化树分析

将测序所得序列与GenBank中的18条毛尾线虫序列进行比较，核苷酸同源性分析表明分离虫体的ITS序列与猪毛尾线虫的核苷酸同源性高达99.8%，从遗传学角度确定其为猪毛尾线虫。进化树分析表明，本研究分离的江西地区的猪毛尾线虫与湖南益阳分离的毛尾线虫(AM993005)亲缘关系最近，与广东湛江3型、湖南长沙2型和广东江阳地区的猪毛尾线虫ITS区存在一定的种内差异，但是核苷酸同源性仍>93.5%(图3)。

“▲”表示本试验测序线虫“▲” indicates the isolate sequenced in the study

3 讨论

随着生物种群的不断进化，对一些相似种或近缘种的鉴定单纯靠寄生虫的形态学越来越困难，亟需新技术的引入和运用。近年来，寄生虫分子分类学、分子鉴定和分子遗传学等技术在寄生虫种(株)鉴定方面取得了很大的进展，如以PCR技术为基础的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、随机扩增多态性DNA(RAPD)及单链构象多态性(SSCP)分析等[9]。由于核糖体DNA的内转录间隔区序列位于18S和28S之间，在生物进化过程中显示种的特性，在种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，故被作为遗传标记广泛用于寄生线虫种类鉴定与分类工作[10]，尤其是种间分类研究[11]。本研究根据病猪体内分离虫体及虫卵的形态对发病猪进行初步诊断，而后对分离虫体的内转录间隔区扩增并测序以及BLAST比对，进一步从分子水平上确认分离的寄生虫为猪毛尾线虫。将测定的ITS序列与18条参考序列进行比对分析，发现其核苷酸同源性高达99.8%，与湖南益阳地区的猪毛尾线虫亲缘关系最近，与其他地区的猪毛尾线虫ITS存在一定的种内差异，为进一步研究猪毛尾线虫的分类鉴定、遗传变异以及其他相关方面的研究奠定了基础。

猪毛尾线虫是一种常见寄生虫，可引起猪毛尾线虫病，感染强度较高，四季均可发生[12]，且夏季发病率相对较高[1]，可通过水、食物或者土壤等途径传播，发病猪主要表现为贫血、腹泻以及渐进性消瘦等临床症状，且多发于保育阶段，育肥阶段存在散发现象[13]。少量毛尾线虫寄生不会引起明显的临床症状，但感染猪体内若有大量虫体寄生时则会出现明显的临床症状，严重者引起死亡，给养猪业造成较大的损失。羟嘧啶是治疗毛尾线虫的特效药，本病例确诊后立即用羟嘧啶进行了全面投药，治疗效果确切。猪毛尾线虫卵具有非常强的抵抗力，成虫的药物耐受性较高，通过一次用药并不能彻底清除虫体和虫卵，需要结合驱虫和改善环境卫生等综合性措施控制本病。因此，每年定期对猪群驱虫是必要措施，通常种猪每年驱虫3次～4次，商品猪驱虫2次～3次；在做好驱虫的基础上，采取改善养殖场及周边的环境卫生、定期消毒等预防措施的实施，可以较大程度上减少猪毛尾线虫病的发生。

参考文献：

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[3] 李 欣,田守龙,何柳芬,等.鹅蛔虫ITS rDNA的分子特征及种类分析[J].动物医学进展,2017，38(4):19-23.

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