还原型谷胱甘肽对氟中毒小鼠睾丸的影响

张孝清，李素娟，曹国弟，孙子龙*

(1.朔州职业技术学院，山西朔州 036002；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

氟中毒属于人兽共患性地方病之一，是一种全身性疾病，可对肝脏、肾脏、神经系统、生殖系统等造成损伤。而氟中毒的非骨相损害中，生殖系统的损伤一直引起人们的关注。氟可以突破血-睾屏障和血-附睾屏障，在生殖部位蓄积，进而影响精子发生过程[1-3]，包括睾丸形态和功能、精子形态、能动性、精子获能、顶体反应等，而这些无论是在体外和体内都是受精的关键过程。

研究表明，机体氟中毒时，体内自由基水平升高，导致氧化应激。氧化应激是氟中毒的作用机制之一，这已经在肝脏、肾脏、脑、睾丸及附睾等组织中得到证实[4-5]。研究表明氧化应激与生殖过程密切相关[6-7]，如卵子发生、卵母细胞成熟、弱精症[8]、死精症及精子DNA 损伤等，亦参与自由基诱导的出生缺陷[9]、诱导胚胎发育缺陷[10]以及流产[11]等的病理过程。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)是生物体内重要的抗氧化物质之一，在动物睾丸、附睾、精子及精浆都有分布，小鼠、大鼠睾丸中GSH含量较高。GSH与谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferases，GSTs)及谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)共同在机体内发挥着重要的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物分组与处理 50只3周龄ICR雄性小鼠，购自北京海淀兴旺实验动物养殖场。小鼠适应性饲养1周，之后随机分成5组，即对照组和4组染氟组。对照组饮用蒸馏水，染氟组分别供给含100 mg/L NaF的蒸馏水，自由饮用30 d。在染氟组中选取3组分成100 mg/L NaF+200 mg/kg GSH组、100 mg/L NaF+400 mg/kg GSH组和100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH组，这3组小鼠每只每日分别以200 mg/kg GSH、400 mg/kg GSH和800 mg/kg GSH的剂量进行灌胃，同时这5组小鼠再自由饮含氟水30 d。饲养环境保持干净整洁，温度20℃左右，湿度适宜，各组小鼠自由饮水、采食。饲养结束后，各组小鼠全部断颈处死，摘取睾丸。

1.1.2 主要试剂和仪器 氟化钠(NaF，AR)购自天津市化学试剂三厂；谷胱甘肽(还原型)购自北京索莱宝科技有限公司；ROS测定试剂盒、MDA测定试剂盒、GST测定试剂盒、GPx测定试剂盒、GR测定试剂盒和BCA法蛋白定量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

全波长扫描多功能读数仪(Varioskan®Flash)，美国赛默飞公司产品；UV-2100紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司产品；生物组织包埋机，金华惠支仪器设备有限公司产品；生物组织切片机，德国徕卡仪器有限公司产品；生物组织摊烤片机，孝感市亚光医用电子技术有限公司产品；生物显微镜，日本奥林巴斯公司产品。

1.2 方法

1.2.1 检测ROS、MDA和GSH的含量及GPx、GSTs和GR的活性 各指标都按照南京建成试剂盒说明书进行检测。按说明将睾丸组织匀浆后采用化学比色法检测ROS、MDA、GSH、GPx、GSTs和GR。

1.2.2 切片制作 摘取睾丸组织，生理盐水冲洗，置于40 mL/L多聚甲醛固定液中固定24 h。自来水冲洗12 h，梯度酒精逐步脱水，置于二甲苯中透明、浸蜡、包埋、切片、烘片。染色前，脱蜡、染色、透明，中性树胶封片，在光镜下观察睾丸组织形态。

做好的切片图像通过Image-Pro Plus5.0软件程序进行测量，测量曲细精管的半径，曲细精管细胞层厚度，之后将数据输出进行处理。

1.2.2 统计方法 试验结果采用GraphPad Prism5统计软件分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 小鼠体重变化

各组小鼠的体重，随着染氟及添加GSH时间的加长，各组体重呈现上升趋势(图1)。染氟组和添加GSH组小鼠的体重增加量与对照组相比，整体呈降低趋势，但差异不显著。

图1 氟化钠与不同剂量谷胱甘肽对小鼠体重的影响

2.2 小鼠相关指标检测结果

添加不同剂量GSH对氟中毒小鼠睾丸相关指标的影响见表1。与对照组相比，100 mg/L NaF组ROS和MDA含量显著升高，GPx活性及GSH含量降低，GSTs和GR活性显著降低。与100 mg/L NaF组相比，添加GSH组ROS和MDA含量有一定程度降低，GR、GPx、GSTs活性和GSH含量有一定程度升高，100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH组GR活性显著升高。

2.3 小鼠睾丸形态结构的变化结果

从图2A图及Image-Pro Plus5.0软件测量可以观察到对照组切片曲细精管结构轮廓清晰致密，曲细精管细胞层厚度较大，各级生精细胞排列有序，曲细精管管腔半径较小，管腔中央可见到大量精子。与图2A相比，图2B即100 mg/L NaF组，曲细精管结构稀疏，曲细精管细胞层厚度变小，各级生精细胞排列紊乱，还有部分生精细胞脱落，曲细精管管腔半径变大，管腔中央精子数量明显减少。

与图2B相比，图2C即100 mg/L NaF+200 mg/kg GSH组，图2D即100 mg/L NaF+400 mg/kg GSH组，图2E即100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH组，出现与100 mg/L NaF组类似的病理变化，即曲细精管结构稀疏，曲细精管细胞层厚度变小，各级生精细胞排列紊乱，还有部分生精细胞脱落，曲细精管管腔半径变大，管腔中央精子数量减少。随着添加GSH浓度的增加，睾丸组织的损伤程度逐渐减弱，特别是100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH组曲细精管结构稀疏减少，曲细精管细胞层厚度变大，各级生精细胞排列紊乱减少，脱落生精细胞减少，曲细精管管腔半径变小，管腔中央精子数量有所增加。

表1 睾丸中相关指标的测定

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与100 mg/L NaF组相比，#P<0.05。

Note：Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01；Compared with 100 mg/L NaF group,#P<0.05.

A.100 mg/L NaF组； B.100 mg/L NaF+200 mg/kg GSH组； C.100 mg/L NaF+400 mg/kg GSH组；D.100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH组；E.图中白色箭头表示生精细胞层(400×)，黄色箭头表示精子(400×)

A.100 mg/L NaF group；B.100 mg/L NaF+200 mg/kg GSH group； C.100 mg/L NaF+400 mg/kg GSH group； D.100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH group； E.The white arrow indicates the germ cell layer (400×) and the yellow arrow indicates the sperm (400×)

图2对照组、染氟组及添加GSH组小鼠睾丸生物显微镜观察

Fig.2 The testes of the control group,the fluoride group and the GSH group were observed under biological microscope

3 讨论

氟中毒会影响动物的生长性能，动物长期氟中毒，体重会相应发生改变。动物体重是一个相当重要且比较敏感、客观的指标，它反映了受试动物对实验动物的生长发育及一般状态的影响，体重的增加和减少都可能会伴随着某种疾病的产生。研究表明，氟中毒会使动物体重降低。本试验结果显示，在氟的作用下，100 mg/L NaF组小鼠体重降低，提示氟化物对小鼠产生影响。与100 mg/L NaF组相比，添加GSH后，各组体重逐渐升高，提示GSH对氟中毒小鼠有一定改善作用。

1975年，Curnutte和Babior首次提出氟化物能刺激细胞产生氧自由基的观点。此后，各国学者广泛研究氧化应激与氟中毒的关系。Ghosh等研究饮水型氟中毒大鼠，发现过量氟所致的生殖系统毒性效应与睾丸氧化应激密切相关。睾丸组织分裂代谢旺盛，富含线粒体及黄嘌呤氧化酶等易生成ROS，且含有大量多聚不饱和脂肪酸，使得睾丸组织对于氧化应激损伤更加敏感。ROS主要有两种来源，一种来自内源性，主要是线粒体电子传递链中的副产物[12]，此外，内质网、微粒体、溶酶体、炎症细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞)，涉及电子传递的其他蛋白质或酶都可能导致ROS的生成[13]；另一种是外源性，例如臭氧、辐射、大气污染、压力及生气等可以产生部分ROS。

谷胱甘肽抗氧化系统是机体抗氧化体系的重要组成部分。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的小分子三肽，可以清除自由基，在体内发挥重要的抗氧化作用。GPx是广泛存在于生物体内的含硒抗氧化酶类，它可以促进H2O2和脂质过氧化物与GSH发生反应，转变成羟基化合物，而GSH氧化生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，阻断了脂质过氧化的自由基链式反应。GSTs可以催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与GSH的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，保护DNA及一些蛋白质免受损伤。同时GSTs在GSH的作用下还可以清除脂质过氧化物，转变成羟基化合物，但不能催化H2O2分解。尽管与其解毒功能相比抗氧化作用不是主要的，但与GPx协同作用则值得重视。GR是一种广泛存在于真核细胞和原核细胞中的以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的黄素蛋白酶。

机体受到ROS等过氧化物损伤时，GSH在GPx、GSTs的催化下，加快对过氧化物的清除，减轻组织细胞的氧化损伤。同时，GSSG又可以在GR的作用下，由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)提供氢把GSSG还原为GSH，确保机体GSH与GSSG的动态平衡，减少脂质过氧化物、H2O2等对机体的毒性影响。

本试验结果显示，与对照组相比，100 mg/L NaF组ROS和MDA含量显著升高，GPx活性及GSH含量降低，GSTs和GR活性显著降低，提示GSH的含量降低，细胞内GSSG的含量增加，这可能是由于GPx或GSTs以GSH作为底物，清除机体内的H2O2等过氧化物，GSH被消耗过多，GSSG被GR还原成GSH 的过程可能受阻。小鼠氟中毒时，睾丸中ROS含量增加，脂质化作用增强，消耗过多GPx、GSTs 和GR，谷胱甘肽抗氧化系统遭到破坏，导致氧化损伤加剧。

与100 mg/L NaF组相比，添加GSH组ROS和MDA含量有一定程度降低，GR、GPx、GSTs活性和GSH含量有一定程度升高，100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH组GR活性显著升高，提示添加外源性的GSH，可以增加睾丸的GSH含量，有助于GPx、GSTs 和GR进行抗氧化反应，在一定程度上可以减轻睾丸内ROS含量，减轻脂质过氧化物造成的损伤，增强了谷胱甘肽抗氧化系统的活性。

本试验选取200 mg/kg GSH、400 mg/kg GSH和800 mg/kg GSH进行灌胃，结果显示100 mg/L NaF+800 mg/kg GSH组谷胱甘肽抗氧化系统活力及睾丸组织结构有一定的改善，但氟中毒后最适宜添加的GSH浓度及GSH对机体的其他影响有待于进一步研究。

参考文献:

[1] Lu Z,Wang S,Sun Z,et al.Invivoinfluence of sodium fluoride on sperm chemotaxis in male mice[J].Arch Toxicol,2014,88(2):533-539.

[2] 吴培福,曲伟杰,郭爱伟,等.氟致小鼠睾丸组织形态结构损伤的观察[J].畜牧与饲料科学,2010,31(4):20-21.

[3] 孙子龙,牛瑞燕,王俊东.氟对雄性小鼠生长发育及性腺中氟含量的影响[J].中国畜牧兽医,2012,39(3):227-229.

[4] Ghosh D,Das S,Maiti R,et al.Testicular toxicity in sodium fluoride treated rats:association with oxidative stress[J].Reprod Toxicol,2002,16(4):383-390.

[5] 杨克敌,刘世海,应晨江.硒对氟致大鼠睾丸和附睾损害拮抗作用的研究[J].中国公共卫生,2002,18(4):52-54.

[6] Sikka S C.Relative impact of oxidative stress on male reproductive function[J].Current Med Chem,2001,8(7):851-862.

[7] Aitken R J,Gordon E,HarkissD,et al.Relative impact of oxidative stress on the functional competence and genomic integrity of human spermatozoa[J].Biol Reprod,1998,59(5):1037-1046.

[8] 张卫东.氧自由基-线粒体信号通路在少、弱精子症发病中的机制研究[D].河南郑州：郑州大学,2015.

[9] Loeken M R.Free radicals and birth defects[J].J Maternal-Fetal Neonatal Med,2004,15(1):6-14.

[10] Enkhmaa D,Kasai T,Hoshi K.Long-time exposure of mouse embryos to the sperm produces high levels of reactive oxygen species in culture medium and relates to poor embryo development[J].Reprod Domestic Animals,2009,44(4):634-637.

[12] 李良德,王定锋,吴光远.线粒体内活性氧产生靶标位点研究进展[J].生命科学研究,2015,19(6):530-535.

[13] 周 崧,易 静.信号配体诱导的活性氧生成[J].细胞生物学杂志,2006,28:656-660.