截短的传染性支气管炎病毒S1基因原核表达与分析

王珊珊，李树东，刘欢欢，高国强，侯喜林

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院 动物传染病诊断与新型疫苗实验室，黑龙江大庆 163319)

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性高度接触性传染病[1]，主要影响产蛋鸡和肉鸡，可导致蛋鸡产蛋量和蛋品质下降，肉鸡死亡率增加和生长性能下降，每年都给养禽业造成严重的经济损失[2-5]。

IBV编码的S蛋白是由S1和S2两个亚单位组成，S1蛋白是IBV的主要免疫原蛋白，它能够介导病毒与细胞融合，刺激机体产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体，且在各血清型之间具有交叉反应[6-7]。S1蛋白也是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白，某些重要氨基酸改变导致抗原决定簇的改变，从而产生新的变异株[8]。不断出现的新的变异株给传染性支气管炎的诊断和防治带来了困难，这也是研究IB疫苗的难点，S1蛋白为疫苗候选抗原，是IBV基因工程疫苗研究的热点。许多学者从腺病毒、马铃薯、杆状病毒等真核表达系统成功表达了S1亚单位蛋白[9-11]，但真核表达系统表达的蛋白量少，不利于目的蛋白的纯化和大量获取。李春萍等[12]用原核表达系统成功表达了S1基因中保守性较好的一段抗原表位区域蛋白,获得了重组蛋白，并成功制备了S1蛋白的单克隆抗体。表明S1蛋白某些抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。本实验选取S1基因中一段抗原表位区域蛋白，成功构建pQE-30-S1原核表达系统，获得了大量的具有较好反应原性的重组蛋白，可以获得大量的重组蛋白，为建立ELISA方法、制备单克隆抗体和后续开发IBV基因工程亚单位疫苗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 H120疫苗株购自浙江诺倍威生物技术有限公司；质粒pQE-30及宿主菌DH5α、大肠埃希菌BL21(DE3)为黑龙江八一农垦大学动物传染病诊断与新型疫苗实验室保存。

1.1.2 主要试剂 pMD18-T、T4连接酶、限制性核酸内切酶和TaqDNA聚合酶等购自Takara公司；抗鸡传染性支气管炎病毒特异性血清购自中国兽医药品监察所；Goat Anti-Chicken IgG/HRP购自北京博奥森生物技术有限公司；RNA提取试剂盒、PCR胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、反转录试剂盒均购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank公布的IBV H120病毒S1基因序列保守区抗原性较高的抗原表位区域设计引物SP1和SP2，上游引物5′端增加了BamHⅠ、下游引物3′端增加了HindⅢ的酶切位点(下划线部分)，上游引物SP1：5′-AAGTGGATCCAAAGGTGTTTATTCAGGTG-3′；下游引物SP2：5′-TTTTAAGCTTACGTCTAAAACGA- CGTGTT-3′；引物由华大基因科技有限公司进行合成。

1.2.2 IBV H120病毒增殖 将IBV H120疫苗株用PBS 1∶100进行稀释，以0.1 mL/胚接种到培养11日龄的SPF鸡胚尿囊腔上，在37℃孵化箱内孵育，24 h照蛋将死胚拿出，取72 h存活的鸡胚于4℃过夜，无菌条件收集尿囊液，置-80℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR获取目的基因 应用TIANGEN试剂盒提取IBV病毒的RNA，并进行反转录，用PCR方法对目的片段进行扩增，PCR在25 μL体系中进行，PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min,60.3℃ 30 s，72℃ 1 min,30个循环，72℃ 10 min进行延伸。PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行检测，鉴定正确后进行50 μL体系的PCR用于目的片段回收。

1.2.4 大肠埃希菌原核表达载体的构建 将纯化后的目的片段与pMD18-T载体连接转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，涂氨苄抗性的LB平板上，过夜培养，挑取单菌落到5 mL含氨苄抗性的LB液体培养基，提取质粒进行酶切、PCR以及测序鉴定，将鉴定正确的目的片段与pQE-30载体分别用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切；将带相应黏性末端的S1和线性载体pQE-30连接后转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，先用菌落PCR方法进行阳性克隆的鉴定；对鉴定正确的阳性菌液扩大培养提取质粒双酶切以及测序进行鉴定。

1.2.5 重组载体的原核表达 将测序正确的重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，并用菌液PCR鉴定阳性菌液，鉴定正确的进行双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性菌液1%接种到含氨苄抗性的100 mL培养基于37℃振荡培养3 h～4 h，当OD600nm值达到0.4时，加入1 mmol/L IPTG进行诱导表达。

1.2.6 诱导浓度和诱导时间的优化 为了确定该蛋白最佳诱导浓度和最佳诱导时间，将鉴定正确的阳性菌液1%接种到100 mL含氨苄抗性的100 mL培养基，37℃、200 r/min振荡培养，当OD nm 600值达到0.4左右时将菌液转移到7个离心管中，6 mL/管菌液，分别加入IPTG终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，37℃诱导，每隔1 h取样，每次取1 mL，6 h取样结束后，将不同IPTG终浓度诱导6 h的菌液以12 000 r/min离心1 min，弃上清后加50 μL PBS缓冲液将沉淀重新悬起，加5×上样缓冲液50 μL振荡混匀，100℃沸水浴10 min，离心后加样5 μL进行SDS-PAGE分析。确定最佳诱导浓度后，将该浓度下诱导的1 h～6 h表达菌液按上述方法处理，SDS-PAGE分析以确定最佳诱导时间，为后续纯化蛋白提供最佳诱导时间与最佳诱导浓度。

1.2.7 表达产物的可溶性分析 取表达6 h的菌液于50 mL离心管中，4℃、5 000 r/min 离心30 min，用PBS溶液重悬菌体，在冰浴中超声破碎，每超声5 s间歇10 s，超声20 min左右，直到菌液变澄清破碎完全，离心分离上清和沉淀，分别取40 μL上清和沉淀加入10 μL的5×上样缓冲液煮沸10 min后离心，50 g/L的分离胶进行SDS-PAGE分析。

1.2.8 重组蛋白的纯化 将诱导后的100 mL菌体，分装到两个50 mL离心管中，4℃、5 000 r/min离心10 min后，弃上清留沉淀，用20 mL破菌缓冲液重悬沉淀，在冰浴中超声破碎，超声20 min左右，每超声5 s间歇10 s，直到菌液变澄清破碎完全，在4℃、5 000 r/min离心10 min后留沉淀用适量PBS重悬，取100 μL沉淀加入100 μL 5×上样缓冲液，用一孔梳进行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白胶放入一干净的培养皿里，加入1 mol/L乙酸钠(pH13)中浸泡1 h，蛋白变成灰白色用干净的刀片将蛋白切下，放入装满电泳液层析袋中，将透析袋放在水平电泳槽内，在120 V的电压下作用30 min可以使蛋白游离出来，电泳后将透析袋放入PBS中过夜，将透析袋放在PGE6000浓缩，收集液体离心取上清，进行SDS-PAGE以及Bradford法蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白纯化效果。

1.2.9 重组蛋白的Western blot鉴定 取上步获得的纯化蛋白进行SDS-PAGE后，经半干转印槽45 V 15 min转印至硝酸纤维膜(NC膜)上，50 g/L的脱脂乳封闭2 h，PBS溶液洗膜4次，每次10 min，再加抗鸡传染性支气管炎病毒特异性血清(1∶500稀释)，37℃孵育2 h，PBS溶液洗膜4次，再加羊抗鸡IgG/HPR二抗(1∶5 000)稀释，37℃孵育1 h，PBS溶液洗膜4次，用DAB显色液观察结果。

2 结果

2.1 目的基因的扩增结果

从收取的尿囊液中提取总RNA，用设计的特异性引物对IBV S1蛋白基因进行RT-PCR扩增，PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果得到468 bp大小的片段，与预期结果相符(图1)。

2.2 重组质粒pQE-S1的鉴定结果

分别用BamHⅠ和HindⅢ限制性核酸内切酶对阳性质粒pMD18T-S1和pQE-30空载体进行双酶切，将目的片段于线性pQE-30载体线性片段进行连接转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，获得的阳性质粒酶切进行鉴定，得到3 461 bp和468 bp的2条片段，并将PCR(图2)和酶切(图3)鉴定正确的阳性质粒进行测序，序列相似性达到99%以上。

M.DNA标准DL 2 000；1～2.PCR产物；3.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000；1-2.PCR products；3.Negative control

图1 S1基因PCR扩增

Fig.1 PCR amplification of S1 gene

M.DNA标准DL 2 000；1.PCR产物；2.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR product；2.Negative control

图2重组质粒PCR鉴定

Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid

M.DNA标准DL 2 000；1.重组质粒；2.pQE-30-S1用BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Recombinant plasmid；2.Products of pQE-30-S1 digested withBamHⅠ andHindⅢ

图3重组质粒的酶切鉴定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

2.3 最佳诱导条件的确定结果

鉴定正确的阳性质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，用IPTG诱导表达，并对诱导浓度和诱导时间进行摸索，SDS-PAGE显示表达的融合蛋白大小在18 ku左右，最佳诱导浓度为0.2 mmol/L(图4)，最佳诱导时间为4 h(图5)。

M.蛋白分子质量标准；1.PQE-30空载体未诱导产物；2.pQE-30空载体诱导产物；3.pQE-30-S1未诱导产物；4～9.重组质粒pQE-30-S1在IPTG浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，诱导6 h表达产物

M.Protein molecular weight Marker；1.Uninduced products of pQE-30；2.Induced products of pQE-30；3.Uninduced products of pQE-30-S1；4-9.Expression products of pQE-30-S1 induced by 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L IPTG for 6 h

图4不同IPTG浓度诱导重组蛋白表达

Fig.4 Recombinant protein expressions induced by different concentrations of IPTG

M.蛋白分子质量标准；1.pQE-30空载体诱导产物；2.pQE-30-S1未诱导产物；3～8.重组质粒pQE-30-S1在IPTG浓度为0.2 mmol/L时，分别诱导1 h～6 h表达产物

M.Protein molecular weight Marker；1.Induced products of pQE-30；2.Uninduced products of pQE-30-S1；3-8.Expression products of pQE-30-S1 induced for 1-6 h by 0.2 mmol/L PTG

图5不同时间诱导重组蛋白表达

Fig.5 Recombinant protein expressions induced at different time

2.4 可溶性分析结果

将超声破碎前的表达产物与超声破碎后的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果超声后上清没有目的条带，超声后沉淀有目的条带，说明该融合蛋白为包涵体蛋白(图6)。

2.5 重组蛋白的Western blot鉴定结果

经Bradford法蛋白浓度测定试剂盒检测纯化后的蛋白浓度为0.427 g/L，将纯化后的蛋白进行Western blot分析，结果显示获得18 ku大小的特异性条带，与预期结果相符，说明成功表达的截短的IBV S1重组蛋白具有很好的反应原性(图7)。

M.蛋白分子质量标准；1.重组质粒pQE-30-S1在IPTG为0.2 mmol/L时诱导4 h后的表达产物；2.pQE-30-S1诱导、超声破碎后上清液；3.pQE-30-S1诱导、超声破碎后沉淀

M.Protein molecular weight Marker；1.Expression products of pQE-30-S1 induced for 4 h by 0.2 mmol/L IPTG; 2.Supernatant of induction pQE-30-S1 after ultrasonic disruption；3.Precipitates of induction pQE-30-S1 after ultrasonic disruption

图6重组蛋白的可溶性分析

Fig.6 Soluble analysis of the recombinant protein

M.蛋白分子质量标准；1.重组蛋白；2.阴性对照

M.Protein molecular weight Marker；1.Recombinant protein；2.Negative control

图7重组蛋白的Western blot鉴定

Fig.7 Western blot analysis of the recombinant protein

3 讨论

IBV为单股、正链RNA病毒，基因组全长27.6 kb，主要编码S、N、M、E 4种结构蛋白[13]，其中S蛋白由S1和S2两种糖多肽构成，S1蛋白是最重要的抗原蛋白[14]，可诱导血凝抑制抗体和大部分病毒中和抗体的产生，还可以在鸡体内诱导MHCI分子限制性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的免疫应答反应[15]。关于IBV基因工程疫苗的研究，基本集中在S1基因上。

外源基因在大肠埃希菌中高效表达，常常会形成生物学功能的蛋白聚集体包涵体[17]，但是包涵体的制备和纯化为有活性的可溶性蛋白常常会遇到很多麻烦，目前常用的方法根据蛋白的性质不同而异,有离子交换柱、亲和层析柱等纯化的效果达不到预期效果。学者们探索更加便捷、有效的呈现目的蛋白的方法,研究表明切胶纯化的方法获得纯化的目的蛋白，不仅回收率高，而且操作简单、经济[17]。于在江等证实了用弱碱性盐显现目的蛋白并切胶纯化包涵体表达蛋白的方法是可行的,且用该法制备的蛋白成功用于p26多抗和单抗的制备,无论是用于Western blot还是ELISA，仍然能保持蛋白原有的抗原性[18]。

根据单克隆抗体和核酸序列分析研究S蛋白上存在8个抗原决定簇，其中S1上有6个抗原中和位点，其氨基酸位置分别为24-61(S1D)、132-149(S1E)、291-389(S1CAB)和497-543(S1F)，其中S1D、S1E、S1CAB(A、B、C3个决定簇有部分重叠)均能诱导产生中和抗体[19]。根据GenBank上公布的IBV H120毒株(GU393335.1)的基因组序列，针对S1基因中保守性较好的一段抗原表位区域设计引物(1 144-1 611 bp)设计合成引物，特异性扩增出468 bp的S1基因，经过测序比对，未发生氨基酸突变，成功克隆了S1基因，并成功构建了原核表达载体PQE-S1，经过诱导，获得18 ku左右的目的蛋白，该蛋白小于理论分子质量(23 ku)。研究证明稀有密码子的存在大大降低了蛋白质合成的速率,使蛋白表达量降低,甚至使蛋白合成中途停止[20]。在截短的S1基因中含有大肠埃希菌稀有密码子，因此稀有密码子的存在可能是导致分子质量偏小的原因，也可能是进行SDS-PAGE的时候蛋白的静电荷影响了迁移率。获得的蛋白以包涵体形式存在，经过改变条件仍不能获得融合蛋白，本试验采用弱碱性盐显现目的蛋白并切胶纯化的方法纯化目的蛋白，Western blot鉴定结果表明该重组蛋白能与鸡的抗IBV多克隆抗体发生特异性反应，具有特异性反应原性。这一研究结果为制备单克隆抗体和后续开发IBV基因工程亚单位疫苗奠定了基础。

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