中缅边境猪群感染猪链球菌2型的病原特性初探

郑玉芳，鲁琼芬，李晓红，张容萍，陈培富

(云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201)

我国是猪肉生产及消费大国，同时也面临众多猪病困扰。其中猪链球菌(Streptococcussuis,SS)感染是世界各地严重威胁集约化养猪业发展的传染病之一。猪链球菌是常见分布于动物皮肤和黏膜的一种条件致病菌，广泛定植于猪的上呼吸道、消化道和生殖道传播[1]。根据荚膜多糖(CPS)的抗原性差异，猪链球菌曾分为35个血清型，即1/2型和1～34型[2]。由于32及34型与其他型差异较大，将二者划为新种，名为鼠口腔链球菌[3]。现在公认的33个血清型，1、1/2、2、7、9、14型是其主要致病性血清型，据报道国内流行菌株主要为血清9型和2型。猪链球菌2型是毒力最强、流行最广泛，也是感染人的最主要的血清型[4]，主要见于欧亚大陆[5]。20世纪90年代以来，国内猪2型链球菌病呈上升趋势。SS2可引起猪脑膜炎、败血症、脓肿等[6]；也可感染人，引起脑膜炎、感染性休克，严重时可致人死亡[7]。国内外时有猪链球菌2型通过伤口引起人感染发病乃至死亡的报道，它是重要的人畜共患病病原，尤其对从事屠宰或加工猪肉的人员危害很大，被认为是食源性致病菌[8]。2016年秋季，中缅边境多个猪场暴发以神经症状、败血症、关节炎为主要特征的传染病，经多种药物治疗效果均不佳。根据临床症状和疾病特点，怀疑该病由链球菌感染所致。本试验采集发病猪病料，分离鉴定病原菌，测定其耐药性，期待为防治该病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病料采集自某公司分设在云南沧源和缅甸佤邦的多个猪场，包括病猪肺脏、血液、脓包及脓汁。病猪为约70日龄仔猪，发病前7 d接种链球菌疫灭活三价疫苗(马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型)，表现呼吸困难、关节肿胀、长脓包、发热等临床症状，部分仔猪拉黄色水样粪便而死，后期出现神经症状、败血症，使用多种药物治疗，效果均不佳。对肺组织和血液提取细胞总DNA或总RNA，分别对猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、日本脑炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型进行RT-PCR扩增检测核酸，结果均呈阴性。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离培养 取病猪肺脏、脓包及脓汁分别划线于绵羊血琼脂和普通琼脂培养基，一部分放置于37℃有氧温箱，剩余放入无氧密封罐中分别培养过夜。观察菌落形态，挑取具有溶血能力的单个菌落转种至新培养基，确保获得纯培养物后，做液体扩大培养，并做好标记。取部分纯培养后菌液加入等量50%灭菌甘油，充分混匀后置-80℃保存。

1.2.2 分离菌株的形态观察和生化试验 取少许剩余菌液，按照常规步骤进行革兰染色，镜检细菌个体形态。用接种环蘸取菌液分别接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、水杨苷、棉实糖、山梨醇、七叶苷、马尿酸盐、甘露醇、65 g/L NaCl、肌醇等12种生化发酵管，放入37℃培养箱培养过夜，第2天观察其颜色变化和气泡产生情况。触酶试验在洁净玻片上完成，受试样滴加1滴30 mL/L H2O2溶液，以滴加1滴生理盐水作为阴性对照。

1.2.3 分离菌株的药敏试验 取扩大培养后的分离菌株悬液200 μL均匀涂布平板，采用KB纸片法做药敏试验，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径，参照美国NCCLS标准(1999-2001)做出判定，即抑菌圈直径在15 mm以上为高度敏感，10 mm～15 mm为中度敏感，10 mm以下为低度敏感，无抑菌环为不敏感或完全耐药。

1.2.4 分离菌株的血清学检查 取洁净凹孔凝集反应板，用灭菌生理盐水对慢性病猪血清做倍比稀释，每孔500 μL，直至210倍，随后每孔加入500 μL细菌悬液，阴性对照孔加入等量的空白培养液，连续搅拌15 min使之混匀，室温放置片刻，观察有无凝集现象。

1.2.5 分离菌株的分子生物学鉴定 取超声波破碎后的菌液2 μL作为模板，加入细菌16S rRNA通用引物(上游引物fD1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物rD1：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′[9])各0.5 μL，分别加入23.5 μL Mix及ddH2O，配制50 μL反应体系，按95℃ 5 min；94℃ 50 s，52℃ 45 s，72℃ 50 s，进行PCR扩增，共循环35次；最后72℃充分延伸10 min。取扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，检查是否产生符合预期大小的单一条带。按照试剂盒方法切胶并回收PCR产物，与pMD-19T载体连接，热刺激法转化DH5α大肠埃希菌感受态细胞，取200 μL菌液涂布含Amp/IPTG/X-Gal的琼脂平板，37℃培养过夜，挑取白色菌落转种含Amp的LB液体培养基，37℃摇动培养，送样至上海生工生物工程技术服务有限公司做DNA测序，所获核酸序列经NCBI网站BLAST进行在线比对分析。

2 结果

2.1 分离菌株的形态特征

病料划线接种于血琼脂长出灰白色、圆形、透明、中央突起，表面光滑、边缘整齐、呈α溶血、针尖大小的半透明小菌落，菌落直径在2 mm～3 mm之间(图1A)，涂片染色镜检可见单个、成双或短链状的G+球菌(图1B)。

A.菌落形态(血琼脂)； B.革兰染色(1 000×)

A.colony morphology (blood agar); B.Gram staining (1 000×)

图1分离菌株的形态特征

Fig.1 Morphology of the bacterial isolate

2.2 分离菌株的生化特性及血清凝集试验

该菌株分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、水杨苷和棉实糖，不分解利用山梨醇、七叶苷、马尿酸盐、甘露醇、65 g/L NaCl、肌醇和30 mL/L H2O2，符合猪链球菌的生化特性；凝集试验结果呈阳性，即肉眼可见细小颗粒状沉淀物，血清抗体效价最高为1∶256，对照孔为阴性。

2.3 分离菌株16S rRNA基因序列分析结果

该菌株16S rRNA基因PCR扩增出约1 500 bp的单一条带(图2)，经过TA克隆、DNA测序和BLAST比对分析，发现与猪链球菌2型第1核酸序列型(ST1)的同源性最高达99%，超过判定为同一菌种所必需的标准(97%)。

M.DNA标准DL 2 000；1～2.16S rRNA基因PCR扩增产物(约1 500 bp)

M.DNA Marker DL 2 000；1-2.PCR products of 16S rRNA gene (about 1 500 bp)

图2分离菌株16S rRNA基因PCR扩增产物凝胶电泳检查

Fig.2 PCR products of the isolate's 16S rRNA gene detected by agar electrophoresis

2.4 分离菌株药敏试验结果

该菌对头孢噻肟、头孢哌酮、恩诺沙星和复方新诺明高度敏感，对青霉素、阿莫西林、庆大霉素和环丙沙星中度敏感，对四环素、多西环素、卡那霉素、新霉素及氟苯尼考表现较强耐药性，对阿米卡星和林可霉素完全耐药(表1)。

表1 药敏试验结果

注：S.高度敏感；I.中度敏感；R.耐药

Note:S.High sensitivity; I.Intermediate sensitivity; R.Resistance

3 讨论

猪链球菌广泛存在于正常猪的呼吸道、扁桃体等组织，据报道健康猪扁桃体的带菌率为35%～70%[10]，甚至100%。但一般认为，猪链球菌的带菌率与猪群是否发生猪链球病无直接关系[11]，其原因可能是菌株间毒力不同。本试验对采集自中缅边境多个猪场病死猪的病料进行病原菌分离培养，从肺脏和脓包中获得同一细菌。借助PCR扩增和DNA测序分析16S rRNA基因，确定该分离菌株为猪链球菌2型ST1，有学者认为ST1属于高致病性猪链球菌2型[12]，对养猪业存在着严重的威胁。本试验所获分离菌株引起的疾病特点与典型菌株感染基本相似，造成猪的脑膜炎、败血症、脓肿等。试验发现该分离菌株具有多重耐药性，可能是曾使用多种抗菌药物造成的，目前如何应对猪链球菌2型耐药谱扩大趋势，对我们来说仍然是一个巨大的挑战。

值得注意的是，该猪群曾在发病前1周接种猪链球菌2型灭活疫苗，但我们仍从病死猪肺脏和脓包分离到猪链球菌2型，且血清抗体的凝集效价达1∶256。由于灭活疫苗诱导动物产生特异性免疫力通常较慢，本试验提供病料的仔猪发病时间与接种疫苗时间较近，从慢性病例血清中检测到的抗体应主要是猪链球菌2型自然感染的结果，推测该疫苗未起到保护作用。已有报道描述猪链球菌2型不同致病性菌株之间的毒力存在很大差异[13]，并非所有的猪链球菌2型都是致命的[14]，会因其地理分布和毒力因子而造成毒力高低的不同。据此可推测引起该猪群自然感染的分离菌株与疫苗菌株存在较大的抗原性及毒力因子差异，具体情况值得深入研究。

到2013年12月31日为止，全世界总共有1 642例人感染猪链球菌的病例，遍及亚洲、欧洲、美洲、大洋洲等。近年来，在美国、泰国、希腊和日本都有人感染猪链球菌的报道[15-18]，其中猪链球菌2型的分离率最高，已造成严重的全球经济和公共卫生问题[19]。猪链球菌不再是一种重要的猪病原菌，更是重要的人兽共患病原菌。因此，应该加强猪链球菌作为人兽共患病原菌的意识。在养殖过程中，应采取严格的生物安全措施，加强日常卫生工作，做到全进全出制管理，专人分管不同圈舍及年龄阶段的猪群，降低猪群密度，减少应激，增强免疫力，严格控制跨境流动，防止交叉感染，做好对该病的防控工作。

参考文献:

[1] Gómez-Gascón L,Cardoso-Toset F,Tarradas C,et al.Characterization of the immune response and evaluation of the protective capacity of rSsnA againstStreptococcussuisinfection in pigs[J].Comp Immunol,Microbiol Infect Dis,2016,47:52-59.

[2] Oh S I,Jeon A B,Jung B Y,et al.Capsular serotypes,virulence-associated genes and antimicrobial susceptibility ofStreptococcussuisisolates from pigs in Korea[J].J Vet Med Sci,2017,79(4):780-787.

[3] Hill J E,Gottschalk M,Brousseau R,et al.Biochemical analysis,cpn60 and 16S rDNA sequence data indicate thatStreptococcussuisserotypes 32 and 34,isolated from pigs,areStreptococcusorisratti[J].Vet Microbiol,2005,107(1):63-69.

[4] 陆承平.兽医微生物学(第5版)[M].北京:中国农业出版社,2013:87-88.

[5] Callejo R,Zheng H,Du P,et al.Streptococcussuisserotype 2 strains isolated in Argentina (South America) are different from those recovered in North America and present a higher risk for humans[J].JMM Case Reports,2016,3(5):e005066.

[6] Doto D S,Moreno L Z,Calderaro F F,et al.Genetic diversity ofStreptococcussuisserotype 2 isolated from pigs in Brazil[J].Can J Vet Res,2016,80(2):106-111.

[7] Bojarska A,Molska E,Janas K,et al.Streptococcussuisin invasive human infections in Poland:clonality and determinants of virulence and antimicrobial resistance[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2016,35(6):917-925.

[8] Ferrando M L,De Greeff A,van Rooijen W J M,et al.Host-pathogen interaction at the intestinal mucosa correlates with zoonotic potential ofStreptococcussuis[J].J Infect Dis,2014,212(1):95-105.

[9] Weisburg W G,Barns S M,Pelletier D A,et al.16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173 (2):697-703.

[10] 李春玲,余炜烈,贾爱卿,等.应用多重 PCR 检测屠宰猪扁桃体中的猪链球菌[J].中国预防兽医学报,2008,30(5):344-348.

[11] Higgins R ,Gottschalk M.Streptococcal diseases[M].8th ed.Ames:Lowa University Press,1999:563-578.

[12] 郑 翰.分析ST1型与ST7型猪链球菌在临床与实验室方面的差异[D].中国疾病预防控制中心,2008.

[13] Auger J P,Fittipaldi N,Benoit-Biancamano M O,et al.Virulence studies of different sequence types and geographical origins ofStreptococcussuisserotype 2 in a mouse model of infection[J].Pathogens,2016,5(3):48.

[14] Athey T B T,Auger J P,Teatero S,et al.Complex population structure and virulence differences among serotype 2Streptococcussuisstrains belonging to sequence type 28[J].PLoS One,2015,10(9):e0137760.

[15] Praphasiri P,Owusu J T,Thammathitiwat S,et al.Streptococcussuisinfection in hospitalized patients,NakhonPhanom Province,Thailand[J].Emerg Infect Dis,2015,21(2):345-348.

[16] Hatrongjit R,Kerdsin A,Gottschalk M,et al.First human case report of sepsis due to infection withStreptococcussuisserotype 31 in Thailand[J].BMC Infect Dis,2015,15(1):392.

[17] Chatzopoulou M,Voulgaridou I,Papalas D,et al.Third case ofStreptococcussuisinfection in Greece[J].Case Reports Infect Dis,2015,2015:505834.

[18] Yamanaka A,Shirahama T,Nishimura N,et al.Streptococcal toxic shock-like syndrome due toStreptococcussuisserotype 2 in a Japanese pig farmer[J].Jpn Asso Infect Dis,2015,89(6):741-744.

[19] Tan M F,Liu W Q,Zhang C Y,et al.The involvement of MsmK in pathogenesis of theStreptococcussuisserotype 2[J].Microbiol Open,2017,6(2):e00433.