推拿手法对颈椎病家兔骨骼肌ATP mRNA表达的影响

王志强，窦思东，林丽莉，毛忠清，陈炬烽

（福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122）

长期低头位引起的颈椎动力性平衡——颈项部肌肉的功能异常是颈椎病发病的主要病因。在颈椎病发生发展过程中，颈背部肌张力异常升高、肌力减弱、动力性失衡，逐渐引起脊柱静力系统（椎体及附件、椎间盘和相连韧带）失衡，形成恶性循环，是颈椎病发病的关键所在［1］。颈部肌肉的损伤既是颈椎病发病的一个重要病因，也是该病重要的症状体现，因此探讨其病变肌肉的病理变化情况，对揭示颈椎病的发病机制和治疗机理具有重要的意义。推拿手法是临床保守治疗颈椎病的有效手段［2-3］，该疗法直接作用于肌肉，其起效过程必然与其对肌肉的影响存在密切联系。故我们采用低头位法制备颈椎病家兔模型，观察推拿手法对肌张力及骨骼肌三磷酸腺苷酶（ATP）mRNA表达的变化，探讨手法治疗颈椎病的内在机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 日本大耳白家兔40只，雌雄各半，体质量（2.30±0.16） kg，6～7 月龄，购自福建医科大学动物实验中心。

1.2 主要试剂和仪器 颈复康颗粒（承德颈复康药业股份有限公司，批号：710065）；RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号：0051501、00041501、0031505）；PCR 引物（南京金斯瑞生物科技公司）；7500 Fast荧光定量PCR仪 （美国Applied Biosystems公司）；Nano Drop 2000超微量核酸测定仪（美国Thermo公司）；ST 16R高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；XW-80A微型漩涡混合仪 （上海沪西分析仪器厂）；TPA-2型智能推拿手法参数测定仪（由上海中医药大学和复旦大学共同开发研制）；SA7550肌电图诱发电位仪（加拿大flexcomp infiniti公司）。

2 实验方法

2.1 造模与分组 按体质量编号，根据分层随机原则，利用SPSS 19.0统计软件的Proc Plan过程随机化将兔子按1∶3比例分为正常组和造模组，先将造模组环境适应性训练3 d，采用低头位法造模：每天将动物固定于特定的兔架上，使其颈椎处于低头屈曲45°的异常应力环境下，每日5 h，连续操作12周。以表面肌电检测张力显著变化作为造模是否成功的客观标准。造模结束后将造模组随机分为模型组、药物组、推拿组各10只。

2.2 干预 造模后第2天完成表面肌电检测后进行相应干预。其中药物组按1 g／（kg·d）予颈复康颗粒进行灌胃。推拿组采用一指禅推法［4］在家兔大椎穴上吸定操作，手法的轻重频率通过TPA-2型智能推拿手法参数测定仪标定，在前期已由专人按手法要求训练达标，一指禅手法操作参数：频率120次／min，每次治疗15 min，每日1次。药物组、推拿组均干预10 d，正常组和模型组无干预治疗。

2.3 取材 实验结束后，称量家兔体重，各组家兔腹腔注射3%戊巴比妥钠25 mL／kg经耳缘静脉注射麻醉，解剖家兔迅速取出两侧后斜方肌，4℃预冷的生理盐水清洗，滤纸吸干肌肉组织表面的水分并称重，计算家兔指数（斜方肌质量／体质量），将一侧肌肉立即投入4%中性甲醛固定液中固定，另一侧肌肉液氮速冻，-80℃冰箱保存。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 表面肌电检测 分别于造模完成第2 d及干预后进行表面肌电的检测，并提前1 d对家兔后斜方肌周围进行剃毛备皮处理。在电极片上涂抹好导电膏，正、负极与参考电极呈正三角形分布，每个电极中心点距离2 cm，正负极顺着受检肌肉的肌纤维轴向放置，将其固定于后斜方肌上；接通肌电信号收集器，采用2通道的Rms+三维频谱的通道，背景参数高通滤波器设置在10～20 Hz，低通滤波器设置在400～450 Hz，开始收集肌电信号，待信号平稳后截取静息阶段数据，观察其波幅变化。

2.4.2 ATP mRNA检测 采用荧光定量PCR方法测定，以GAPDH为内参。将RNA提取后，逆转录合成cDNA。 配制 10 μL 反应体系：dNTP Mix 2 μL，Primer Mix（引物）1 μL，RNA 模板 4.5 μL，5×RT Buffer 2 μL，SuperQuickRT Mix 0.5 μL，而后涡旋震荡混匀，短暂离心，37℃孵育15 min，85℃孵育5 s；反应结束后短暂离心，所得的cDNA可放在-20℃长期保存。最后进行荧光定量PCR检测：① 配制25 μL反应体系。完成之后，短暂离心；② 进行PCR反应程序：采用三步法（变性，退火，延伸）扩增循环。每个样本做3个复孔，将3个复孔得到的Ct值取平均，并根据2-ΔΔCt计算出mRNA相对表达量。

2.5 统计学方法 应用SPSS 19.0软件对所有数据进行处理。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 4组干预前后肌张力比较 见表1。

表1 4组干预前后肌张力比较（x±s） μV

3.2 4组ATP mRNA表达水平比较 见表2。

表2 4 组 ATP mRNA 表达水平比较（n＝3，x±s）

4 讨 论

流行病学调查表明，不良的劳动姿势是职业性肌肉骨骼损伤的一个重要因素，其中最主要的是强迫体位的影响［4］，而强迫屈颈体位是颈椎病发病的危险因素之一。强迫体位使机体产生的静态负荷容易引起肌肉疲劳，血液循环减弱，可致组织缺血，代谢产物清除减慢，长时间可造成肌肉损伤。当肌肉疲劳时，它的肌电一般表现为肌纤维的兴奋传导速度减慢，波幅一般有一定的增加。我们的实验表明：造模12周后，家兔肌电图表现出了肌源性损害，肌张力显著增高，经过药物或推拿治疗后，家兔的肌电图征象明显好转，且推拿组波幅降低程度明显高于药物组，提示推拿对颈椎病肌张力的改善效果显著优于药物治疗。

肌肉组织由于长期缺血缺氧，线粒体功能障碍，ATP生成不足，我们的实验结果也观察到了这类现象，这使依赖于 ATP供能的各类酶活性下降［5］。再者，因代谢产物的减慢，导致自由基生成增加，而自由基也是酶损伤的重要因素，可导致其活性下降［6］。 Na＋-K＋-ATP 酶活性下降主要使细胞膜电位紊乱，Ca2＋-ATP酶活性下降导致细胞内钙超载激惹一系列代谢紊乱，两者均可致结构退变，甚至丧失生命力［7］。而整个肌细胞的损伤，最终导致骨骼肌损伤。椎后肌肉如若不能正常调节颈椎动力学平衡，导致动力系统失衡，进一步引起颈部椎体-韧带-椎间盘组织构成的静力平衡系统的失衡，最终导致整个颈椎系统生物力学功能的紊乱，使颈椎稳定性丧失，出现颈椎间盘的退变而发病。在这个病变过程中，我们的研究结果提示：及早进行推拿手法治疗能有效提高ATP酶mRNA的表达，有助于促进ATP酶的合成和活性，从而减轻或者避免肌细胞的损伤，进而有利于颈椎动力系统平衡的恢复。在下一步的实验中，我们将深入观察推拿手法对该疾病病理过程中ATP酶合成和活性的影响。

综上所述，实验研究结果提示：① 手法能有效改善颈椎病的高张力状态，显著降低肌张力；表面肌电在一定程度上能有效反映颈椎病的疾病状态和治疗效果，可以作为临床颈椎病评价的一种客观指标。②作为临床颈椎病保守治疗的常用手段，手法治疗颈椎病疗效显著，这与手法能显著促进颈椎病骨骼肌ATP酶mRNA的表达，促进ATP酶的合成和活性，挽救肌细胞，存在一定的相关性，其内在机制有待进一步深入研究。③本次选用的一指禅推法具有刺激舒适、渗透性强等优势，易于被患者所接受，配合大椎穴激发阳气，通督扶阳，把手法和穴位扶助阳气的作用结合取得了显著的效果，这种效果我们将在下一步临床实验中加以验证。

［1］ 王拥军.施杞教授关于颈椎病理论与临床的探讨［J］.中国中医骨伤科杂志，1997，5（3）：60-62.

［2］ 王昊，左伟斌，张慧，等.推拿对慢性神经根型颈椎病疼痛相关脑区的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2017，23（6）：854-857，860.

［3］ 许军，顾非，刘鲲鹏，等.三步推拿法治疗颈型颈椎病临床推广应用研究［J］.天津中医药，2018，35（1）：25-27.

［4］ 王起恩，王生，牛云彤，等.强迫体位致骨骼肌线粒体动态变化的研究［J］．中华劳动卫生职业病杂志，1996，14（3）：142-144.

［5］ 徐建广，顾玉东，李继峰.缺血对失神经肌肉超微结构及酶组织化学的影响［J］.中华实验外科杂志，2003，20（6）：499-500.

［6］ 吴小春.自由基与钠钾 ATP酶的损伤［J］.国外医学（临床生物化学与检验学分册），1991，12（2）：54-58.

［7］ 沈燕国，徐建光，顾玉东，等.人体失神经支配骨骼肌 Na，KATP酶、Ca-ATP酶及糖原的变化［J］.复旦学报（医学版），2002，29（5）：343-346.