稳定同位素13C或D标记对甲氧基苯甲酸的合成

王 伟，杜晓宁，徐建飞，雷 雯

(上海化工研究院有限公司 上海稳定性同位素工程技术研究中心，上海 200062)

对甲氧基苯甲酸(p-methoxybenzoic acid)又称对茴香酸、大茴香酸。稳定同位素13C或D标记对甲氧基苯甲酸是防腐剂、香料及药物等稳定同位素标记内标试剂的重要中间体。稳定同位素标记内标试剂在食品安全检测[1-2]、新药筛选和复杂基质中相关代谢物的定量分析中越来越受到关注[3-6]。如合成13C或D标记3-氨基-4-甲氧基苯甲酸及对甲氧基苯甲酰氯，同时也可作为13C或D标记茴拉西坦、乙胺磺肤酮等的医药中间体。

天然丰度对甲氧基苯甲酸的合成主要采用硫酸二甲酯与对羟基苯甲酸或对甲酚为原料，在碱性条件下通过甲基化反应获得[1-2]，该方法因稳定同位素标记硫酸二甲酯合成难度较大而不适合稳定同位素标记对甲氧基苯甲酸的合成；也有研究者以对甲苯酚和碘甲烷为原料，利用相转移催化法制备对甲氧基苯甲酸[3]，该方法反应条件苛刻、后处理难度大。Wang等[4]以CD3I和对羟基苯甲酸为原料，经双甲基化、脱甲氧基(-CD3)后得到对甲氧基苯甲酸-D3，该工艺需要过量2倍(2 eq)的稳定同位素原料，成本较高。Jemal等[5]以1.2 eq的CD3I和对羟基苯甲酸为原料，通过控制加入碱的量，选择性合成对甲氧基苯甲酸-D3，但该工艺得到的产物中同时含有羟基位甲基化产物和羧基位甲基化产物，普通的纯化过程难以获得纯度较高的对甲氧基苯甲酸-D3，上述2种工艺过程中，对羟基苯甲酸在碱性条件下首先与CD3I反应生成对羟基苯甲酸甲酯-D3，再与过量的CD3I反应生成对甲氧基苯甲酸甲酯-D3，最后通过脱-CD3基团生成对甲氧基苯甲酸-D3，不仅成本较高，而且反应过程易发生酯交换等副反应。

本文以稳定同位素13C或D标记碘甲烷和尼泊金乙酯(对羟基苯甲酸乙酯)为原料，经甲基化、碱解、重结晶后可得到纯度较高的稳定同位素标记对甲氧基苯甲酸，该工艺路线简便，甲氧基选择性高，同位素利用率高，适于稳定同位素13C或D标记对甲氧基苯甲酸的合成。

1 主要仪器与试剂

RE-52型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪高科仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；岛津2020型液质联用仪(LC-MS)：日本岛津公司；精科WRS-2C型熔点仪：上海精密仪器仪表有限公司；JNM-ECZR核磁共振仪：日本电子株式会社(JEOL)。

碘甲烷-13C(13CH3I)：13C同位素丰度>99%，上海化工研究院有限公司产品；碘甲烷-D3(CD3I)：D同位素丰度>98.5%，上海化工研究院有限公司产品；碘甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、尼泊金乙酯、无水乙醇、乙酸乙酯、无水硫酸镁等试剂均为市售分析纯或化学纯：国药集团上海化学试剂公司，使用前均未进一步纯化。

2 实验方法

2.1 合成条件的选择

采用单因素实验确定了稳定同位素标记对甲氧基苯甲酸合成工艺的反应温度、物料摩尔比及反应时间。进行工艺条件筛选时，为节省成本，采用的同位素原料实际为天然丰度原料。在后续用稳定同位素13C或D标记碘甲烷代替天然丰度碘甲烷时，对反应的收率和同位素原料利用率的趋势没有影响。

2.2 对甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成

对甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成路线示于图1。

图1 对甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成路线Fig.1 Synthetic route of [13C/D3] p-methoxybenzoic acid

在带有磁力搅拌和温度计的250 mL三口烧瓶中，N2保护下加入4.15 g(25 mmol)尼泊金乙酯、6.90 g(50 mmol)K2CO3、4.08 g(28.75 mmol)13CH3I，及50 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。磁力搅拌下将反应液通过油浴锅升温至80 ℃，回流反应6 h，趁热过滤除去不溶物。向滤液中加入50 mL乙酸乙酯及20 mL盐酸，萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋蒸浓缩后的产物可直接进行下一步反应。

在带有磁力搅拌和温度计的250 mL三口烧瓶中，N2保护下加入上一步反应产物、40 mL NaOH溶液，及10 mL无水乙醇，加热回流2 h，冰水浴下，用2 mol/L 盐酸调节反应液pH至1，析出白色固体，乙醇-水重结晶后得白色结晶产物，即为对甲氧基苯甲酸产品。产品经干燥、称重后得3.47 g白色结晶，收率为91.23%，纯度为99.0%，碘甲烷利用率(同位素原料利用率)为79.33%，熔点为185.5～187.4 ℃。

3 结果与讨论

3.1 合成条件

3.1.1反应温度

固定碘甲烷与尼泊金乙酯的摩尔比为n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1，反应时间为6 h，考察反应温度对同位素原料(碘甲烷)利用率的影响，结果示于图2。由图2可知，反应温度的变化对同位素原料利用率的影响较大，当反应温度低于80 ℃时，随反应温度升高，原料利用率逐渐升高；当反应温度高于80 ℃时，易发生酯交换等副反应，使原料利用率降低。因此，适合的反应温度为80 ℃。

图2 反应温度对同位素原料利用率的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on the utilization of isotope material

3.1.2物料摩尔比

由于稳定同位素原料价格昂贵，为降低产品的开发成本，理论上应使非同位素原料过量，但该反应过程中，若使尼泊金乙酯过量，则容易发生酯交换副反应，造成收率降低。因此，本文拟使碘甲烷过量，考察物料摩尔比对产物收率及碘甲烷利用率的影响。

固定反应温度为80 ℃，反应时间为6 h，考察物料摩尔比n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)对产物收率及同位素原料利用率的影响，结果示于图3。

由图3数据可知，当n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1∶1时，反应收率及碘甲烷利用率均为65%，随着碘甲烷加入量的增加，当n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)>1.15∶1时，反应收率基本维持不变，但碘甲烷利用率降低。因此，合适的物料摩尔比为n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1。

图3 物料摩尔比对产物收率及原料利用率的影响Fig.3 Effect of material mole ratio on product yield and isotope utilization

3.1.3反应时间

固定碘甲烷与尼泊金乙酯的摩尔比为n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1，反应温度为80 ℃，考察反应时间对同位素原料(碘甲烷)利用率的影响，结果示于图4。

图4 反应时间对同位素原料利用率的影响Fig.4 Effect of reaction time on the utilization of isotope material

由图4可知，随着反应时间的延长，同位素原料利用率提高较快，当反应时间大于6 h时，同位素原料利用率有所下降，这可能是反应时间过长致使副反应发生。因此，合适的反应时间为6 h。

3.2 稳定同位素13C或D标记

在单因素试验优化的工艺条件下，用碘甲烷-13C(13CH3I)和碘甲烷-D3(CD3I)分别代替天然丰度碘甲烷，合成了对甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C和对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3产品。其中，对甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C收率为91.12%，纯度为99.1%，13C同位素丰度为99.0%，13C稳定同位素原料利用率为79.32%，熔点为186.5～187.8 ℃；对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3收率为90.49%，纯度为99.0%，D同位素丰度为98.1%，D稳定同位素原料利用率为78.70%，熔点为186.3～188.1 ℃。同位素丰度均未出现明显稀释，说明该工艺路线可行。

3.3 产品的表征

对甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的LC-MS图谱示于图5。主峰ESI-MS-：m/z=152[M-H]-，比天然丰度对甲氧基苯甲酸多1个质量数，计算13C同位素丰度为99.0%。

图5 甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的质谱图Fig.5 MS of [13C] p-methoxybenzoic acid

图6 甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的质谱图Fig.6 MS of [D3] p-methoxybenzoic acid

对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的LC-MS图谱示于图6。主峰ESI-MS-：m/z=154[M-H]-，比天然丰度对甲氧基苯甲酸多3个质量数，计算D同位素丰度为98.1%。

对甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的核磁共振(1H NMR)图谱示于图7。1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：8.06(2H,d,ph-H),6.94(2H,d,ph-H),3.87(3H,m,Me-H)。

图7 甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的1H NMRFig.7 1H NMR of [13C] p-methoxybenzoic acid

对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的1H NMR图谱示于图8。1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：8.07(2H,d,ph-H),6.95(2H,d,ph-H)，与天然丰度对甲氧基苯甲酸1H NMR相比，无δ=3.87的位移，说明氘同位素取代位置与预期相同。

图8 甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的1H NMRFig.8 1H NMR of [D3] p-methoxybenzoic acid

4 结论

(1) 本文以稳定同位素13C或D标记碘甲烷和尼泊金乙酯为原料，碱性条件下经2步反应制备得到稳定同位素13C或D标记对甲氧基苯甲酸，反应条件温和、对设备无特殊要求。

(2) 采用单因素试验对合成工艺关键步骤进行优化，得到了适合的反应温度、物料摩尔比、反应时间等工艺条件，产品的收率大于91%，稳定同位素原料(CD3I和13CH3I)利用率均大于78%，降低了产品的开发成本。

(3) 产品经LC-MS进行纯度和同位素丰度分析，经1H NMR进行结构确认，化学纯度均大于99%，13C同位素丰度为99.0%，D同位素丰度为98.1%，同位素丰度未出现明显稀释。

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