生物素链霉亲和素联合免疫层析用于快速检测NT-proBNP

孙宏浩，梁玉芬,，赵晓双，黄 玲，廖天作

(1湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北省工业发酵协同创新中心，发酵工程教育部重点实验室，武汉430068;2江西中医药高等专科学校 医学基础部，抚州344000)

NT-proBNP是由脑钠肽原(pro-BNP)经内切酶酶切产生的一种无活性的N端多肽片段，主要存在于心肌细胞对心室壁的张力或局部缺血作出应答所产生的分泌物中[1].大量研究表明：NT-proBNP半衰期较短，稳定性强，可作为心力衰竭诊断测试的主要指标，在疾病诊断及预后评估阶段具有重要作用[2].在患有心力衰竭和其他心血管疾病的患者体内，NT-proBNP的浓度明显升高，且与心功能受损程度呈正相关[3].对于NT-proBNP的定量检测，可用于心血管疾病的临床诊断、预后判断及治疗效果评价[4].目前，定量检测NT-proBNP的方法主要有：放射性免疫检测技术[5]、酶联免疫吸附测定[6]、电化学发光免疫分析[7]及荧光免疫层析技术[8].放射性免疫检测技术成本较低，但存在潜在的放射污染可能，由于试剂具有半衰期，每次操作都要做标准曲线，逐渐被非放射标记免疫测定技术所取代.酶联免疫吸附测定被广泛应用，但操作繁琐、费时费力，且准确性和灵敏度较低.电化学发光免疫分析广泛应用于定量检测NT-proBNP，其中，罗氏(Roche)Elecsys 电化学发光免疫分析系统具有高灵敏性和准确性，常用于生物标志物的快速检测[9]，但需要大量样本才能降低成本，不适用于中小型机构及个人对NT-proBNP的定量和快速检测检测.此外，昂贵的检测设备及所需试剂使电化学发光免疫仪器在中小医疗机构很难普及，更无法用于POCTs.目前，基于荧光标记物的免疫层析技术发展迅速，各种荧光标记物也不断涌现，如金磁复合纳米球MNP@SiO2@BSA@AuNPs用以定量检测肌红蛋白[10],荧光免疫层析技术与电化学发光免疫检测技术相比，该方法具有操作简单、成本低、检测快速，但检测灵敏度较低.

在NT-proBNP免疫层析检测中，由于T线抗体和抗原-荧光微球复合体仅有15 s的作用时间, 因此在心力衰竭检测中NT-proBNP的有效检测限需要达到20 ng·L-1[11].在抗原浓度低、反应时间极短的条件下，单一的免疫层析技术很难实现对低浓度NT-proBNP的准确检测.利用生物素和链霉亲和素之间高度特异性亲和力以及多级放大效应，可提高免疫结合和示踪分析的灵敏度[12].目前，该技术已被广泛应用于追踪抗原和抗体，定性和定量检测以及追踪定位等研究中.生物素与链霉亲和素之间的结合力可达1015mol·L-1，且两者结合快速，耐受性强，一旦形成高亲和力，就不会受到极端pH、温度、有机溶剂以及其他变性剂的影响，这些因素对于纯化或检测结合蛋白均具有重要作用[13].因此，本文采用生物素-链霉亲和素系统与荧光免疫层析技术相结合的方法，以期实现简便、快速、灵敏检测NT-proBNP(原理图见图1).

图1 生物素-链霉亲和素系统结合荧光免疫层析技术检测NT-proBNP的原理图Fig.1 Schematic diagrams of biotin-streptavidin system combined with fluorescenceimmunochromatography for detecting NT-proBNP

1 实验部分

1.1 材料与仪器

MES缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、PB(磷酸盐溶液)均购于国药集团化学试剂有限公司，抗体5B6、抗体15F11、抗体15C4、抗体13G12、抗体24E11、抗体29D12、抗体18H5、抗体16E6、NT-proBNP(Hytest Ltd)，牛血清白蛋白(BSA, Roche)，生物素、链霉亲和素(Sigma Aldic)，羊抗鼠IgG(Abcam)，400 nm荧光微球(北京华泰昕生物医疗)，PVC底板、样品垫、吸水纸、硝酸纤维膜均(上海金标生物技术).

喷金划膜仪(XYZ-3050，美国BIO-DOT)，切条机(HGS201，杭州峰航科技)，离心机(H-2050R，湖南长沙湘仪离心机仪器)，超声清洗器(DH-120DTN，上海狄昊实业)，旋转混匀仪(MX-RD-E，Biologix Group Ltd.)，荧光快速检测仪(HG-98，上海互帼科学仪器)，快速免疫分析仪(AQT90 FLEX，雷度米特医疗设备).

1.2 抗体对的筛选

以抗体5B6为偶联抗体，选择合适抗体与5B6配对构成双抗体夹心模型.以5B6作为标记抗体，抗体15C4、抗体13G12、抗体24E11、抗体15F11、抗体29D12、抗体18H5、抗体16E6分别作为T线抗体，制备免疫层析试纸条，分别对浓度为30000,9000, 0 ng·L-1的NT-proBNP进行检测，计算T/C值，绘制柱形图.

1.3 制备抗体5B6标记的荧光微球

1.4 生物素化抗体的制备

1.5 免疫层析试纸条的制备

在聚氯乙烯板上使用样品垫、硝酸纤维膜及吸水纸组装免疫层析试纸条，在NC膜上，以0.6g·L-1抗体15F11作为T线，0.1g·L-1羊抗鼠IgG作为C线.切割为4 mm的条状，将试纸条置于卡壳中常温干燥保存.

1.6 生物素-链霉亲和素联合免疫层析试纸条的制备

1.7 NT-proBNP的定量检测

使用1.5中制备的免疫层析试纸条，在样品垫处分别滴加浓度为30, 20, 9,5, 3, 1.5, 0.9, 0.5, 0.2, 0.15, 0.02 μg·L-1的标准样品，并与1.3制备的荧光微球0.5L反应1 min，取pH 7.4的PB缓冲溶液作为层析液，分别检测T线及C线的荧光强度，计算T/C值.绘制T/C-浓度标准曲线.

使用1.6中制备的新型试纸条，将1.3制备的荧光微球0.125L与1.4中制备的生物素化抗体2L混合，滴加至结合垫处，以200 mM pH 7.4的PB缓冲溶液作为层析液，分别取浓度为30, 20, 9, 5, 3, 1.5, 0.9, 0.5, 0.2, 0.15, 0.02 μg·L-1的标准样品添加至样品垫处，反应1 min.检测T线及C线的荧光强度，计算T/C值，绘制T/C-浓度标准曲线.

1.8 全血检测

使用1.6中制备的新型试纸条对4组血液样本(编号A1，A2，A3，A4)进行免疫层析检测，并根据1.7中标准曲线计算血液样本中NT-proBNP浓度.运用雷度快速免疫分析仪对相同血液样本进行检测，比较两者所测结果.

2 结果与分析

2.1 抗体对的筛选结果

以5B6作为标记抗体，选择7个不同的抗体对进行免疫层析试验，并针对不同浓度NT-proBNP进行检测，通过层析结果，计算每组的T/C值，结果如图2.由图2可知：以5B6作为标记抗体，15F11作为划线抗体时，不同浓度T/C值区分度较大，故而选择5B6-15F11为最佳抗体对.

图2 不同抗体对的免疫层析试验结果Fig.2 Immunochromatographic test results of different antibody pairs

2.2 免疫层析方法检测NT-proBNP

用免疫层析方法检测NT-proBNP结果见图3.由图3可知：当浓度为0.02～0.5 μg·L-1时，T线无荧光信号；浓度为0.5～9 μg·L-1时，T线荧光强度较低，且T/C值区分度差；浓度为20～30 μg·L-1时，T线荧光强度较高.

图3 免疫层析法检测NT-proBNP的荧光光谱Fig.3 NT-proBNP fluorescence spectra by immunochromatographic assay

NT-proBNP浓度与T/C值的关系曲线见图4.由图4可知：在较低浓度下，T/C区分度较低，且与浓度无明显相关性，故在较低浓度范围内，常规免疫层析方法并不能在T线实现对抗原-抗体的快速捕捉，无法对低浓度NT-proBNP进行定量检测.

图4 NT-proBNP浓度与T/C值的关系曲线Fig.4 Relationship curve of NT-proBNP concentration and T/C value

2.3 生物素-链霉亲和素联合免疫层析检测NT-proBNP

生物素-链霉亲和素联合免疫层析检测NT-proBNP检测结果见图5.图5显示：在不同NT-proBNP浓度下，检测线和质控线的荧光强度区分度良好，且在较低浓度范围(0.02～0.2 μg·L-1)内，该方法仍能实现T线链霉亲和素对生物素-15F11-抗原- 5B6-荧光微球复合体的高效捕获.

图5 生物素-链霉亲和素联合免疫层析检测NT-proBNP的荧光光谱Fig.5 NT-proBNP fluorescence spectra by biotin-streptavidin system combined with immunochromatographic assay

为进一步证明联合检测方法的可行性，绘制T/C值与抗原浓度的关系曲线结果见图6.如图6所示，两者呈较好的线性关系.

图6 NT-proBNP浓度与T/C值的关系曲线 Fig.6 Relationship curve of NT-proBNPconcentration and T/C value

2.4 全血层析结果

使用新型免疫层析试纸条对A1, A2, A3, A4四组血样进行NT-proBNP快速检测，并运用雷度快速免疫分析仪对相同血样进行定量检测，对比两者检测结果，如表1所示. 由表1可知：针对不同全血样品，对比本试验研制的新型免疫层析试纸条所测NT-proBNP浓度与雷度快速免疫分析仪定量检测结果，两者差异较小.因此，生物素-链霉亲和素系统结合免疫层析技术制备的试纸条可用于临床快速检测中.

表1 全血检测结果

3 结语

本试验利用生物素-链霉亲和素系统的高亲和力以及多级放大效应，结合免疫荧光技术制备新型免疫荧光试纸条.试验结果表明，相较于常规免疫层析技术，新型免疫层析试纸条NT-proBNP在低浓度下(0.02 ～ 0.2 μg·L-1)仍具有较好的区分度，T/C值与抗原浓度呈良好的线性关系.在全血检测中，对比新型免疫层析试纸条检测结果与雷度检测结果，两者相差较小.生物素链霉亲和素系统联合免疫层析技术优于常规免疫层析检测技术，可广泛应用于床旁检验(POCTs)等临床诊断阶段.

参 考 文 献

[1] McKie P, Burnett J C Jr. NT-proBNP : The gold standard biomarker in heart failure[J]. J Am Coll Cardiol,2016,68(22):2437-2439.

[2] Zheng Y R, Ye L F, Cen X J, et al. Low NT-proBNP levels: An early sign for the diagnosis of ischemic heart failure[J]. Int J Cardiol,2017, 228:666-671.

[3] 杨春莉,裘宇容,周 芳,等.血清N端前体脑钠肽在心血管病患者的表达及其临床意义[J]. 南方医科大学学报,2008,28(5):866-869.

[4] 张勇法,杨建英.免疫学检测技术在真菌毒素及兽药残留检测中的应用[J]. 中国饲料,2014 (16):33-35.

[5] Sallam K M,Sidkey N M,Abed N N,et al.Lipopolysaccharide-

stimulated interleukin-6 production for radioimmunoassay[J].J Radioanal NuclCh,2017,313(2):445-453.

[6] Marri L,Jansson A M,Christensen C E,et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of diacetyl (2,3-butanedione)[J]. Anal Biochem, 2017, 535: 12-18.

[7] Liu Q, Liu X P, Wei YP,et al.Electrochemiluminescence immunoassay for the carcinoembryonic antigen using CdSe:Eu nanocrystals[J].Microchimica Acta, 2017,184(5):1353-1360.

[8] Nardo F D,Anfossia L,Giovannolia C,et al.A fluorescent immunochromatographic strip test using Quantum Dots for fumonisins detection[J].Talanta ,2016,150: 463-468.

[9] 王明良,范金芬.(Roche)罗氏全自动电化学发光分析仪的评价[J].医学信息旬刊,2010,23(4):219-220.

[10] 孙宏浩,王甜甜,廖天作,等.金磁复合纳米球的制备及其在检测肌红蛋白中的应用[J].中南民族大学学报(自然科学版),2017,36(1)：8-12.

[11] Zhang X G, Shu Y G, Gao J, et al. A new method for blood nt-probnp determination based on a near-infrared point of care testing device with high sensitivity and wide scope[J]. Biomed EnvironSci, 2017,30(6): 426-431.

[12] 杨 林,罗富里,李 赟,等.利用生物素-链霉亲和素进行骨髓间充质干细胞的表面标记[J].中国组织工程研究,2016,20(10):1382-1388.

[13] 陈 瑜,胡爱国.新型生物素标记的苦杏仁苷活性探针的合成[J].合成化学, 2015,23(4):346-349.