维持性血液透析患者载脂蛋白E基因多态性与心血管并发症的关系

郑昌志，王 娟，齐向明，吴永贵

终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)是最常见的致死性疾病之一，血液透析(hemodialysis,HD)是主要的肾脏替代治疗方法。即便透析技术已有所改善，但HD患者的死亡率仍旧较高。有研究[1]表明，与健康人群相比，行HD的ESRD患者死亡率较高的主要原因是心血管并发症，包括冠心病、心力衰竭和外周血管疾病 。据报道[2]，载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)是一些心血管疾病(如心肌梗死和冠状动脉疾病)的遗传风险因素。作为一种主要的人体蛋白，ApoE的主要作用是通过与低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)受体相互作用来调节细胞内胆固醇水平和脂质摄入。ε 2、ε 3和ε 4为ApoE最常见的的三个多态性等位基因，分布频率分别为8.4%、77.9%和13.7%，这三种等位基因分别代表ApoE的E2、E3和E4的三个同构体[3]。ApoE基因多态性与多种疾病相关，如2型糖尿病、心血管疾病，阿尔茨海默病等，且已有报道指出ApoE的ε 4等位基因与总胆固醇(total cholesterol，TC)和LDL-C的高水平有一定关联[4]。然而，ApoE基因多态性对ESRD接受维持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者的心血管并发症的影响却鲜有报道。该研究旨在了解ApoE基因多态性与ESRD MHD患者心血管并发症之间的关联。

1 材料与方法

1.1病例资料选取2014年6月～2017年6月于我院行MHD治疗的189例ESRD患者，所有患者使用聚砜膜透析器(天津海迪尼国际贸易有限公司，天津，中国)和碳酸氢盐透析液(透析液流量：500 ml/min，血流量：200～250 ml /min)进行规律透析，通路为中心静脉导管或动静脉内瘘，透析频率为每周3次，每次约4 h。其中男103例，女86例，男女比例1.2 ∶1；年龄25～75(46.21±9.40)岁。入选标准如下：① 满足ESRD诊断标准; ② 入组前2个月内无急性感染、手术和创伤史; ③ 无严重的心脏，脑，肺，肝脏疾病; ④ 无严重出血倾向或输血史；⑤ 除肾性贫血外，无其他血液疾病。排除标准如下：① 本研究期间接受不规则血液透析的患者;② 怀孕或正在育婴期的患者;③ 合并低血压患者；④ 肿瘤、严重心功能不全、活动性肝炎和风湿性疾病的患者。原发病组成为：慢性肾小球肾炎58例，糖尿病性肾病47例，良性小动脉肾硬化33例，15例慢性间质性肾炎，肾盂肾炎9例，多囊肾7例，痛风性肾病4例，2例梗阻性肾病，14例原因不明确。同期选取165名健康人群作为对照组，其中男90例，女75例，年龄23～72(45.12±9.09)岁。两组间年龄、性别差异无统计学意义。

1.2方法

1.2.1临床观察与生化检测 抽取对照组及实验组透析前空腹静脉血，检测血脂，通过ELISA法检测脂联素，酶测试法测血肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，脂质法分别检测TC、三酰甘油(triglyceride ，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、LDL-C，通过ELISA实验检测血清白蛋白(serum albumin，ALB)。观察实验组患者行HD后的心血管并发症：如低血压、高血压、冠心病及慢性心功能不全。采用WHO标准[5]诊断低血压和高血压；明尼苏达州标准[6]用于诊断冠心病；Framingham心力衰竭诊断标准[7]诊断慢性心功能不全。

1.2.2PCR-RFLP 通过PCR-RFLP检测位于第四外显子中的ApoE基因；收集每位受试者外周静脉血(3～5 ml)，采用1%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的常规酚法提取DNA。将DNA浓度稀释至10 ng/μl。通过PCR-RFLP检测位于第四外显子中的ApoE基因。由Primer Premier 5.0软件设计PCR引物；上游引物：5′-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3′；下游引物：5′-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3′。PCR反应体系为25 μl。 PCR扩增条件为：Stage1预变性：95 ℃ 5 min；Stage2循环反应：95 ℃ 30 min，65 ℃ 30 min，72 ℃ 30 min；(循环45次)；Stage3延伸阶段：72 ℃ 10 min。将PCR扩增产物转移至0.5 ml无菌管中，加入0.5 μl Hhal酶(10 U/μl)后充分振荡。离心一段时间后，将无菌管在37 ℃水浴箱中放置3 h以上。收集总共10 μl的酶水解产物，以8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(19 ∶1)，在120 V的条件下进行电泳90 min。使用溴化乙锭进行染色，并在紫外灯下观察结果。

1.2.3ApoE基因型及等位基因分布频率 根据ApoE的不同基因型，将其分为3组：ε 2组(ε 2/ 2和ε 4/ 2基因型)；ε 3组(ε 3/ 3和ε 3/ 2基因型); ε 4组(ε 4/ 3和ε 4/ 4基因型)。使用印迹杂交法检测ApoE基因型，比较不同基因型的基线特征及等位基因分布频率，并观察与心血管并发症的关系。

2 结果

2.1实验组与对照组生化指标比较实验组脂联素、Scr、BUN、TC、LDL-C及TG显著高于对照组，HDL-C和ALB均明显偏低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) PCR-RFLP检测法鉴定ApoE的6种常见基因型，基因名称及所包含片段长度如下：含两个片段的ε 3/3基因型(91 bp、48 bp)、ε 4/4基因型(72 bp和48 bp)、ε 2/2基因型(91 bp、83 bp); 含有三个片段的ε 4/3基因型(91 bp、72 bp和48 bp)、ε 3/2基因型，(91 bp，83 bp和48 bp)、ε 4/2基因型(91 bp，83 bp和48 bp)。各片段经PCR扩增及Hhal酶水解后进行凝胶电泳，见图1。

2.3实验组和对照组ApoE基因型和等位基因分布频率Hardy-Weinberg平衡表明，两组样本实际基因型和理论基因型的频率差异无统计学意义，且基因型的分布具备遗传均衡的群体代表性，其中ε 3/3和ε 4/3基因型在两组中出现频率最高，其次是ε 2/2和ε 4/2，而ε 4/4和ε 3/2为最低。与对照组相比，实验组中ε 3/3和ε 3明显下降，而ε 4/3和ε 4明显上升(均P<0.05)，说明ε 3/3和ε 3是ESRD MHD患者心血管并发症的保护性因素，而ε 4/3和ε 4则为危险性因素。两组间其他基因型和等位基因的分布频率差异无统计学意义。见表2。

表1 实验组与对照组各生化指标比较

表2 实验组和对照组ApoE基因型和等位基因频率的比较

表3 ApoE基因型与ESRD MHD患者在ε 2、ε 3和ε 4组的基线特征之间的关系

与ε 2组比较：*P<0.001;与ε 3组比较：#P<0.001

图1 PCR-RFLP检测ApoE基因型

2.4ApoE基因型与ESRDMHD患者在ε2、ε3和ε4组的基线特征之间的关系患者在年龄、性别、ALB、TG和LDL-C的浓度在不同ApoE基因型中无明显差异(均P>0.05)。ε 4组中脂联素，Scr、BUN、TC均高于其他组，而ε4组HDL-C低于其他组(P<0.05)。 ε 3组与ε 2组比较，HDL-C水平较高，脂联素、Scr、BUN、TC水平较低(均P<0.05)。见表3。

2.5ESRD行MHD患者心血管并发症发生率及与在ε2，ε3和ε4组ApoE基因型的相关性与其他组患者相比，ε 4组的MHD患者更可能患有低血压，高血压，冠心病和慢性心功能不全的并发症(均P<0.05)。ε 3组患者在ε 2和ε 4组患者中心血管并发症更少(均P<0.05)。见表4。

2.6MHD患者心血管并发症的危险因素以心血管并发症作为独立变量行二元逻辑回归分析，因变量中有心血管并发症赋值1，无心血管并发症赋值0；自变量：基因型自变量，ε 3组基因型赋值0，ε 4组基因型赋值1；脂联素、Scr、BUN、TC、HDL-C等自变量均为数值变量。结果证实ε 3和ε 4组的基因型与尿毒症血透患者的心血管并发症相关，ε 3及ε 3/ 3是其保护性因素，而ε 4与ε 4/ 3则为危险性因素(均P<0.05)；而其他指标不是其危险性因素(均P>0.05)。见表5。

表4 ESRD MHD患者在ε 2，ε 3和ε 4组ApoE基因型心血管并发症发生率

与ε 2组比较：*P<0.05; 与ε 3组比较：#P<0.05

表5 Logistic回归分析ESRD患者心血管并发症的危险因素

3 讨论

3.1ESRDMHD患者生化指标实验组中脂联素、Scr、BUN、TC、TG、LDL-C明显高于对照组，而ALB和HDL-C均低于对照组。有研究[8]证实，血浆脂联素水平取决于肾功能，BUN和Scr升高提示肾功能损害，肾功能损害患者脂联素水平明显增加；高水平LDL-C、高TC和TG可导致肾损伤，且LDL-C水平升高是日本男性患慢性肾脏疾病的独立因素[9]，故脂质代谢可通过影响肾脏功能，进而影响脂联素、Scr及BUN的水平。

3.2ApoE基因型和ESRDMHD患者在ε2、ε3和ε4组的基线特征及等位基因分布频率本研究显示ε 4组的脂联素，Scr、BUN和TC水平均高于其他组，而HDL-C水平低于其他组。ε 3组与ε 4组相比则具有相反的趋势。肾小球硬化是致使Scr和BUN水平升高的基础，而ApoE则与肾小球硬化的进展相关[10]。一项有关健康人血肌酐水平与ApoE多态性关联性的研究表明ApoE携带者(ε 4/3和ε 4/4)倾向于具有最低的Scr水平[11]。 因ε 4 基因在脂肪细胞中明显具有较高的表达率[12]，既往研究证实ε 4可增加个体脂肪摄入中LDL-C水平，降低HDL-C水平[13]，含有ε 4的个体，TC和LDL-C水平明显高于其他个体，反之HDL-C水平则较低[14]。另外，本研究中实验组中ε 3/3及ε 3的分布频率明显低于对照组，反之ε 4/3和ε 4则显著偏高。且现已均知高水平LDL-C可增加心血管疾病的风险，HDL-C因可提取组织内胆固醇并转移致肝脏代谢排出则益于心血管系统和肾功能[15]。综上可知，ε 4及ε 4/3可被认为是ESRD MHD患者心血管并发症的危险性因素。与本研究一致的是Dekroon et al[16]曾报道，ε 4等位基因通过改变脂质成分代谢使心血管疾病发生风险升高。

3.3ESRD行MHD患者心血管并发症发生率及与在ε2、ε3和ε4组ApoE基因型的相关性通过本实验可知，ε 4组患者的ESRD MHD患者更有可能出现低血压，冠心病和慢性心功能不全的并发症，而ε 3组患者的并发症发生率则较低。以往研究证实血浆脂质升高是心血管疾病的主要风险，ApoE多形性通过其他生物化学途径影响血浆中的脂质组成和心血管疾病进展；ε 4等位基因增加认知衰退、中风、高血压和冠状动脉疾病的风险[17]。此外，本研究回归分析表明，ε 3/3及ε 3是ESRD MHD患者心血管并发症的保护性因素，ε 4/3和ε 4是相关危险性因素。尽管多项研究表明ε 4等位基因是心血管并发症的一项高危因素，然而ε 3等位基因在某些疾病中的保护作用仍有待进一步探索。

总之，本研究证实ApoE基因多态性对ESRD MHD患者心血管并发症发生发展具有一定的影响及ε 4基因型和其等位基因可增加此类患者发生心血管并发症的风险，为预防和治疗ESRD MHD患者的心血管并发症提供了临床意义。但因本实验受样本量较小的限制，未来则需扩大样本量进一步探索ApoE基因多态性对ESRD MHD患者心血管并发症的影响。

[1] Sui W,He H,Yan Q,et al.Genome-wide analysis of histone H3 lysine9 trimethylation by ChIP-seq in peripheral blood mononuclear cells of uremia patients[J]. Hemodial Int 2013,17(4):493-501.

[2] Lopez M F,Krastins B,Ning M.The role of apolipoprotein E in neurodegeneration and cardiovascular disease[J].Expert Rev Proteomics,2014,11(3):371-81.

[3] Liu C C,Liu C C,Kanekiyo T,et al. Apolipoprotein E and Alzheimer disease: risk, mechanisms and therapy[J]. Nat Rev Neurol,2013,9(2):106-18.

[4] Eisenberg D T, Kuzawa C W, Hayes M G.Worldwide allele frequencies of the human apolipoprotein E gene: climate, local adaptations, and evolutionary history[J]. Am J Phys Anthropol,2010,14,3(1):100-11.

[5] Singh R B,Beegom R,Ghosh S,et al.Epidemiological study of hypertension and its determinants in an urban population of North India[J].J Hum Hypertens,1997, 11(10):679-85.

[6] Haywood L J.Coronary heart disease mortality/morbidity and risk in blacks. I: Clinical manifestations and diagnostic criteria: the experience with the Beta Blocker Heart Attack Trial[J]. Am Heart J,1984,108(3 Pt 2):787-93.

[7] Satizabal C L,Beiser A S,Chouraki V,et al.Incidence of dementia over three decades in the framingham heart study[J]. N Engl J Med,2016,374(6):523-32.

[8] Heidari M,Nasri P,Nasri H.Adiponectin and chronic kidney disease; a review on recent findings[J].J Nephropharmacol,2015,4(2):63-8.

[9] Oda E,Kawai R.Low-density lipoprotein (LDL) cholesterol is cross-sectionally associated with preclinical chronic kidney disease (CKD) in Japanese men[J]. Intern Med, 2010,49(8):713-9.

[10] Zhou T B,Qin Y H,Lei F Y,et al.ApoE expression in glomerulus and correlation with glomerulosclerosis induced by adriamycin in rats[J].Ren Fail,2011,33(3):348-54.

[11] Liberopoulos E N,Miltiadous G A,Cariolou M,et al.Influence of apolipoprotein E polymorphisms on serum creatinine levels and predicted glomerular filtration rate in healthy subjects[J].Nephrol Dial Transplant,2004,19(8):2006-12.

[12] Huang Z H,Gu D,Mazzone T.Role of adipocyte-derived apoE in modulating adipocyte size,lipid metabolism,and gene expressioninvivo[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2009,296(5):1110-9.

[13] Zhang M D,Gu W,Qiao S B,et al.Apolipoprotein E gene polymorphism and risk for coronary heart disease in the Chinese population: a meta-analysis of 61 studies including 6 634 cases and 6 393 controls[J].PLoS One, 2014,9(2):e95463.

[14] Taylor A E,Guthrie P A,Smith G D,et al. IQ,educational attainment, memory and plasma lipids: associations with apolipoprotein E genotype in 5 995 children[J].Biol Psychiatry,2011,70(2):152-8.

[15] Zhang Y P,Lu M G,Duan D D,et al.Association between high-density lipoprotein cholesterol and renal function in elderly hypertension: a cross-sectional study in Chinese population[J].Medicine (Baltimore),2015,94(14):e651.

[16] Dekroon R,Robinette J B,Hjelmeland A B,et al.APOE4-VLDL inhibits the HDL-activated phosphatidylinositol 3-kinase/Akt Pathwayviathe phosphoinositol phosphatase SHIP2[J].Circ Res,2006,99(8):829-36.

[17] Midorikawa K,Soukaloun D,Akkhavong K,et al.APOE genotype in the ethnic majority and minority groups of laos and the implications for non-communicable diseases[J].PLoS One,2016,11(5):e0155072.