999感冒灵颗粒抗呼吸道合胞病毒的初步研究

2018-07-04程茂胜袁晓玲张晓燕黄升海

安徽医科大学学报 2018年6期

孙涛，程茂胜，袁晓玲，张晓燕，黄升海

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)属于副黏病毒科肺炎病毒属，是一种有包膜非节段的单股负链RNA病毒，主要有3种包膜糖蛋白(F、G、SH)，其中G蛋白为吸附蛋白，可以与细胞表面的特异性受体结合，F蛋白为融合蛋白，感染细胞后会引起细胞融合病变，RSV感染主要是由这两种蛋白引起的。有研究[1-4]表明，呼吸道合胞病毒是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒病原体。70%的1岁儿童感染过RSV，2岁儿童几乎均被RSV感染过，早产儿及其患有先天性心脏病的儿童更容易引起RSV相关的下呼吸道感染，特别是支气管炎和细支气管炎，是1岁以下儿童住院的最主要原因[5]。此外研究[5-6]表明，婴幼儿感染RSV后不仅可以导致急性疾病，还可导致长期的不良后果，如诱发气道高反应性、诱发哮喘儿童出现反复的喘鸣等，导致病毒血症，严重者会发生心力衰竭导致死亡。RSV感染的病理机制尚不明确，目前为止仍无有效的药物和疫苗接种，曾有以福尔马林灭活的RSV作为疫苗预防接种婴幼儿，发现自然感染RSV后与其未接种疫苗的感染者相比会出现更为严重的支气管痉挛性肺炎，并会造成死亡。临床上治疗RSV感染多采用抗病毒和抗炎联合治疗[7]。

999感冒灵颗粒主要成分为三叉苦、金盏银盘、野菊花、岗梅、咖啡因、对乙酰氨基酚、马来酸氯、苯那敏、薄荷油，辅料为蔗糖粉。主要功能是解热镇痛，用于感冒引起的头痛、发热、鼻塞、流涕、咽痛等。目前已有文献[8-10]报道，野菊花和薄荷油均具有抗呼吸道合胞病毒的功效，而999感冒灵作为一种感冒药对呼吸道合胞病毒的抗性作用却未见文献报道。因此开展对999感冒灵颗粒的抗病毒研究，可为临床有效地预防和治疗RSV疾病提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1细胞及病毒HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)，呼吸道合胞病毒为国际标准Long株，以上均由安徽医科大学微生物学教研室保存。

1.2主要试剂新生牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；Hyclone胰酶(北京利维宁生物科技有限公司)；CCK-8试剂盒(500T；海门碧云天生物技术研所)；利巴韦林注射液(1 ml ∶0.1 g；济宁辰欣药业股份有限公司)；999感冒灵颗粒(每袋重10 g；华润三九医药股份有限公司)；各种规格的培养板(美国Falcon公司)。

1.3细胞培养细胞的复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，立刻放入37 ℃水中进行水浴，使其在1 min内融化。然后将冻存管中的细胞接种到细胞培养皿中加细胞培养液置37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。8 h后更换细胞培养液继续培养。传代：打开已经长成单层细胞的培养皿，用移液枪将废液弃去；然后再用移液枪吸取1～2 ml灭菌的PBS清洗细胞表面的死细胞以及残留血清，一般清洗2～3次；向培养皿中加入0.25%的胰酶1 ml进行消化，在倒置显微镜下观察，待细胞变圆、细胞间质变大，立刻终止消化。加入4 ml细胞培养液，用移液器反复吹打细胞成为细胞悬液。将细胞悬液转移到离心管中4 ℃、1 000 r/min离心5 min。轻轻吸取上清后用细胞培养液重悬细胞，把细胞一分为二转移到新的培养皿中。将接种好的细胞置37 ℃、5% CO2培养箱进行培养。

1.4实验分组、病毒复苏与病毒感染量的测定实验分组为:① 直接灭活组；② 抑制吸附组；③ 抑制增殖组；④ 阻断作用组。病毒的复苏：从-80 ℃冰箱取出病毒管，用细水流冲洗管壁，使其缓慢融化。4 ℃、1 000 r/min离心5 min，将病毒上清液接种至已长成单层的HEp-2细胞培养皿中进行增殖，然后放在37 ℃、5% CO2培养箱中吸附2 h。之后加入细胞维持液再进行培养，观察细胞生长情况以及病变效应(cytopathic effect，CPE)。“-”为无细胞病变，细胞病变<25%为“+”，细胞病变25%～50%为“”，细胞病变50%～75%为“”，细胞病变>75%为“”。等细胞病变效应达到“”时，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集上清液分装后放入-80 ℃冰箱备用。病毒滴度测定：将增殖后的病毒用维持液进行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13不同浓度梯度稀释，依次接种于已长成单层的96孔HEp-2细胞培养板孔中，每孔0.1 ml。37 ℃吸附2 h后，弃上清液，加维持液后放在37 ℃、5 % CO2的恒温培养箱中培养，24 h后观察细胞病变，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。

1.5999感冒灵颗粒的毒性测定将999感冒灵颗粒用含DMEM培养液稀释成400 mg/ml,再用含3%血清的培养液进行1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024倍比稀释，将稀释后的药液加到已长成单层的HEp-2细胞96孔培养板中，每孔100 μl，每个浓度梯度做4个复孔，同时设正常HEp-2 细胞作为空白对照组。重复3次试验。然后将96孔板放在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养3 d，并且每天观察细胞病变。3 d后计算细胞不出现病变(999感冒灵颗粒对HEp-2细胞的毒性作用)的最高稀释倍数，即为其最大无毒浓度(maximum non-toxic concentration，TC0)，即对HEp-2细胞的最大无毒浓度，再按Reed-muench 法计算其50%毒性浓度(median toxic concentration，TC50)。

1.6阳性对照利巴韦林注射液的细胞毒性测定将利巴韦林注射剂用含DMEM培养液初步稀释，再用含3%血清的培养液进行1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024倍比稀释，将稀释后的药液加到已长成单层的HEp-2细胞96孔培养板中，每孔100 μl，每个浓度梯度做4个复孔，同时设正常HEp-2 细胞作为空白对照组。重复3次试验。然后将96孔板放在37 ℃、5 % CO2恒温培养箱中培养3 d，并且每天观察细胞病变。3 d后计算细胞不出现病变(利巴韦林注射液对HEp-2细胞的毒性作用)的最高稀释倍数，即为其TC0，即对HEp-2细胞的最大无毒浓度，再按Reed-muench 法计算其TC50。

1.7对病毒复制增殖的抑制作用将已长成单层的HEp-2 细胞96孔培养板吸弃培养液，用PBS 洗3次，加入100 TCID50的RSV病毒液，100 μl/孔，置37 ℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，使病毒进入细胞；弃去多余病毒液，用PBS洗2次，洗去游离的病毒，再加入999感冒灵颗粒溶液从TC0浓度开始作连续2 倍系列稀释的6个浓度稀释液(维持液稀释)，100 μl/孔，每个浓度均重复4个复孔，同时设正常细胞对照组和病毒对照组以及阳性对照组(阳性对照组浓度为利巴韦林最大无毒剂量)。重复3次试验。当病毒对照组病变达到75%以上时，每孔加入10 μl的CCK-8试剂，培养4 h以后测定波长在450 nm的吸光度(absorbance，A)值。计算药物的抑制百分率，评价抗病毒效果。根据各组之平均吸光度值，计算抑制百分率，再按Reed-Muench法计算药物半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，求出治疗指数(therapeutic index，TI)。

抑制百分率(%)=(实验组平均A值-病毒对照组平均A值)/(细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值)×100%，记录实验结果。TI=TC50/IC50进行计算。

1.8对病毒的直接灭活以TC0浓度开始作连续2倍系列稀释的8个浓度稀释液(维持液稀释)，分别与100 TCID50的RSV病毒液等量混合，37 ℃作用2 h，然后接种到已长成单层的HEp-2细胞96孔培养板中，放在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中吸附2 h，弃上清液，加维持液200 μl。同时设正常细胞对照组和病毒对照组以及阳性对照组(阳性对照组浓度为利巴韦林最大无毒剂量)。其余同1.6。

1.9抑制病毒的吸附以TC0浓度开始作连续2倍系列稀释的8个浓度稀释液(维持液稀释)，分别与100 TCID50的RSV病毒液等量混合，直接接种到已长成单层的HEp-2细胞96孔培养板中，放在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中吸附2 h，弃上清液，加维持液200 μl。同时设正常细胞对照组和病毒对照组以及阳性对照组(阳性对照组浓度为利巴韦林最大无毒剂量)。其余同1.6。

1.10对病毒的阻断作用以TC0浓度开始作连续2倍系列稀释的8个浓度稀释液(维持液稀释)，加入到已长成单层的HEp-2 细胞96孔培养板中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，用PBS洗2次，然后加入100 TCID50的RSV病毒液，置37 ℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，弃上清液，加维持液200 μl。同时设正常细胞对照组和病毒对照组以及阳性对照组(阳性对照组浓度为利巴韦林最大无毒剂量)。其余同1.6。以上每组实验均设立4 ～ 8个复孔进行。

1.11统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，多样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验统计学分析，Reed - Muench法计算药物TC50和IC50及TI，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1RSV病毒半数感染量的滴定病毒TCID50的滴定结果为：1×10-6.23/0.1 ml。

2.2999感冒灵颗粒的细胞毒性测定按Reed-muench 法计算，可得知TC50=2-4；TC0=2-5。因为999感冒灵颗粒原液浓度为400 mg/ml，所以TC50=25 mg/ml；TC0=12.5 mg/ml。利巴韦林的细胞毒性测定TC50=93.1 mg/ml，TC0=5.0 mg/ml。

2.3999感冒灵颗粒在HEp-2细胞的抗呼吸道合胞病毒实验

2.3.1对病毒复制增殖的抑制作用 RSV感染HEp-2细胞出现CPE的特征主要为细胞圆缩、肿胀以及细胞之间的融合。在药物的TC0的范围内，药物浓度的越高，细胞出现CPE的程度会越低。病毒的抑制百分率与药物的浓度具有量效关系且与病毒对照组比较差异有统计学意义(t=8.56、17.71、6.98、7.99、5.51、13.21，P<0.01)，见表1。其对呼吸道合胞病毒的IC50为4.42 mg/ml,TI为5.66；利巴韦林阳性对照组IC50为1.30 mg/ml，TI为71.6(F=54.44，P<0.01)，见图1。说明999感冒灵颗粒对RSV的复制增殖有抑制作用。

2.3.2对病毒的直接灭活实验结果表明，999感冒灵对病毒有直接灭活的作用，主要表现在随着药物浓度的增加，细胞的CPE特征随之降低，细胞的存活率也随之上升且与病毒对照组比较差异有统计学意义(t=16.32、8.63、5.56、6.71、13.1、9.33，P<0.01)，见表1。其对呼吸道合胞病毒的IC50为7.43 mg/ml,TI为3.36；利巴韦林阳性对照组IC50为1.12 mg/ml，TI为83.1(F=7.51，P<0.05)。见图2。

2.3.3抑制病毒的吸附结果可见，在TC0以下的不同浓度实验组中细胞均出现肿胀、圆缩以及细胞融合等典型的CPE症状。细胞的抑制百分率与细胞对照组比较差异无统计学意义(t=1.31，P>0.05)，利巴韦林阳性对照组IC50为1.53 mg/ml，TI为60.1(F=239.46，P<0.01)，见表1。所以999感冒灵颗粒并没有抑制病毒吸附的作用。

2.3.4对病毒的阻断作用实验结果表明，999感冒灵颗粒对病毒并无阻断作用，对呼吸道合胞病毒的感染无预防作用。具体表现在不同药物浓度下细胞均出现典型的CPE症状，CCK-8结果显示细胞的抑制百分率与病毒对照组比较差异无统计学意义(t=1.12，P>0.05)，利巴韦林阳性对照组IC50为1.44 mg/ml，TI为64.7(F=103.23，P<0.01)，见表1。

图1 CCK-8法测定不同浓度药物抑制病毒增殖作用

图2 CCK-8法测定不同浓度药物直接灭活病毒结果

组别浓度(mg/ml)CPE细胞对照-病毒对照阳性对照+实验组抑制增殖12.50+∗∗##6.250 ∗∗##3.125 ∗∗##1.563 ∗##0.782 ∗∗##0.391 ∗## 直接灭活12.50 ∗##6.250 ∗##3.125 ∗##1.563 ∗##0.782 ∗##0.391 ∗## 抑制吸附12.50 6.250 3.125 1.563 0.782 0.391 阻断作用12.50 6.250 3.125 1.563 0.782 0.391

与阳性对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与病毒对照组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

在临床疾病谱中，由病毒引起的感染性疾病比例高达75%以上，一直威胁人类的生命与健康，其中最常见的是呼吸道合胞病毒引起的感染[11]。但目前并没有行之有效的抗RSV治疗手段，唯一用于治疗的是广谱抗病毒药物利巴韦林，由于其具有很强的毒副作用，所以仅限于病情严重和高危患儿，在临床实践运用中效果并不理想。人类单克隆抗体-palivizumab(Synagis)和静脉用免疫球蛋白己经注册使用，疗效较好，但是其一个周期治疗所需费用很高，不能普遍应用于临床。因此，寻找有效廉价的防治RSV感染的药物意义非凡。

国内已有相关文献[12]报道证实，野菊花、薄荷油等天然药物成分具有一定的抗RSV和其他种类病毒的作用与功效。而本实验所使用的999感冒灵作为一种常见的感冒药其主要有效成分为野菊花、薄荷油，但其对RSV的抗性作用却未见文献报道。因此开展对999感冒灵颗粒的抗病毒研究，为其可能的预防RSV感染提供了一定的依据。本文设计了一系列实验，运用细胞培养技术对999感冒灵颗粒抗RSV作用进行了体外研究。实验结果表明，999感冒灵颗粒对RSV也有明显抑制作用。这将可能为开发高效、特异的防治RSV感染的药物奠定实验基础，并为临床处方的配伍提供线索。同时国外文献[12-13]也有相关的报道，野菊花对流行性感冒病毒、乙型肝炎病毒等有一定杀灭作用，其也被应用对治疗各种瘟疫、痈肿病证，疗效确切，也能与其他西药抗生素药物结合使用。近年来，国内外学者运用现代理论知识进行了全面分析和研究，作了大量的药理临床工作，从科学的角度证实了野菊花具有抗病毒、广谱抗菌、抗肿瘤等多种药理作用[14]。

熊建文等[15]研究表明，CCK-8法检测细胞活性，最佳的检测时间是在加入CCK-8试剂细胞培养4 h后，最佳检测波长为450 nm。与传统的MTT比色法检测细胞活性相比，CCK-8法具有操作更加简便，结果更加准确可反复进行测量等多个优点。传统的MTT比色法在检测细胞活性时，需要加入裂解液(如DMSO)溶解沉积在细胞中的甲臜晶体，在此过程中可能会出现晶体颗粒不完全溶解以及在吸取上清夜过程中容易吸走部分细胞，而且加入的裂解液对A值也有一定的影响，所以在吸光度测定时误差很大，重复性欠佳。而CCK-8法中出现的甲臜晶体是水溶性的，并不需要加入裂解液，也不用吸取上清液，不会造成细胞的流失。而且可以进行反复测量，重复性好，数据稳定，科学性强。所以本实验采用CCK-8法测定细胞的吸光度值。

本文初步研究了999感冒灵颗粒抗RSV的作用效果，TC50为25 mg/ml，最大无毒浓度TC0为12.5 mg/ml。CCK-8结果表明999感冒灵颗粒对RSV有直接灭活的作用，并且随着药物浓度的升高，灭活的效果也增强。说明999感冒灵颗粒可能对RSV有直接杀灭的作用，或者有可能药物中的某种化合物与病毒的某一特异性受体结合，从而使病毒直接灭活，并与阳性对照组作用效果相似。同样地，999感冒灵颗粒对抑制病毒在细胞中的复制增殖有显著效果，并在12.5 mg/ml浓度下与阳性对照组相比有着相似作用效果，其作用机制可能是药物进入细胞抑制了相关蛋白的生物合成或者抑制了核酸的复制。但999感冒灵颗粒对病毒的进入并无阻断作用，也没有抑制病毒吸附的作用。说明999感冒灵颗粒并不能阻止病毒侵入细胞与吸附细胞表面，所以并没有预防的作用。本实验证实999感冒灵颗粒体外具有抗RSV感染的作用，而且安全性亦较高。但具体是什么成分具有抗病毒作用还需进一步探究。后期也将采用动物模型对999感冒灵的抗病毒作用以及作用机制进行进一步的研究。

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