雷公藤红素腹腔注射对大鼠卵巢癌移植瘤的抑瘤作用及其机制

王诗尧，孙晶

(1广州中医药大学第二临床医学院，广州 510000；2深圳市妇幼保健院)

近年来卵巢癌的发病率和病死率仍不断增加,尤其有远处转移的患者，预后较差，5年生存率不足30%。研究表明雷公藤红素可抑制多种类型肿瘤生长并诱导其凋亡，有良好的抗肿瘤的作用[1,2]，但有关雷公藤红素治疗卵巢癌移植瘤的研究较少，且具体机制尚不明确[3]。本研究观察了雷公藤红素对大鼠卵巢癌移植瘤的抑瘤作用，并探讨PI3K/mTOR信号通路和PTEN 蛋白在其中发挥的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞及主要药物、仪器 60只SPF级F344大鼠由广东省职业卫生检测中心提供，动物许可证号: SYXK(粤)2014-0048，周龄4～6周，雌性，体质量160～180 g。人卵巢癌HO-8910 细胞由上海钰博生物科技有限公司提供，用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的Hyclone培养液，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，间隔2～3 天需用胰酶消化传代1 次，传代3次后用于造模。

1.2 大鼠分组、卵巢癌移植瘤模型的建立及雷公藤红素应用 将60只F344大鼠随机分为A、B、C组，各20只。各组大鼠饲养1周适应环境后，消毒右腋下皮肤，皮下接种人卵巢癌HO-8910 细胞溶液0.2 mL(细胞浓度2×107/mL)，密切观察，移植瘤肉眼可见即为造模成功[4]。3组大鼠均造模成功。造模成功后固定大鼠，碘伏消毒大鼠反麦氏点皮肤、回抽无血无气泡，C组予雷公藤红素40 mg / (kg·d)腹腔注射、B组予顺铂注射液40 mg /(kg·d)腹腔注射，A组予同等体积生理盐水腹腔注射。各组均给药30 d。

1.3 各组大鼠移植瘤体积测算 给药前、给药后30 d每组各处死10只大鼠，测移植瘤长径、短径，肿瘤体积=(长径×短径2)/2。

1.4 各组大鼠卵巢癌移植瘤组织PI3K、p-mTOR、PTEN检测 采用Western blotting法。取给药30 d各组大鼠移植瘤，加入1 mg/mL的RIPA裂解液1 mL，匀浆机3 000 r/min匀浆15 min, 低温离心机 12 000 r/min 离心10 min后取上清，-20 ℃保存待用。BCA法测定蛋白浓度。8%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，TBST洗3 次,每次10 min，5%牛奶封闭2 h后，TBST 再洗3 次，每次10 min。加入PI3K抗体(工作浓度1∶1 000)、 p-mTOR抗体(工作浓度1∶1 000)、 PTEN抗体(工作浓度1∶1 000)、β-actin抗体(工作浓度1∶2 000)4 ℃过夜，TBST 再洗3 次。加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔抗体(工作浓度1∶2 000)，室温2 h , TBST 再洗3 次，显色。采用Flo urChem V2 .0 凝胶成像分析软件记录每条电泳条带的灰度值。 以目的蛋白条带与内参照β-actin条带灰度值之比表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 给药前和给药后30 d各组大鼠卵巢癌移植瘤体积比较 给药前和给药后30 d各组大鼠卵巢癌移植瘤体积见表1。与给药前相比，给药后30 d各组大鼠卵巢癌移植瘤体积均大于给药前(P均<0.05)；给药后30 d，C组肿瘤体积小于A、B组(P均<0.05)，B组肿瘤体积小于A组(P<0.05)。

表1 给药前和给药后30 d各组大鼠卵巢癌移植瘤体积比较

注：与给药前相比，*P<0.05；与A组相比，#P<0.05；与B组相比，ΔP<0.05。

2.2 各组大鼠卵巢癌移植瘤组织PI3K、p-mTOR、PTEN表达比较 各组大鼠卵巢癌移植瘤组织PI3K、p-mTOR、PTEN相对表达量见表2。卵巢癌移植瘤组织PI3K、p-mTOR、PTEN相对表达量C组高于B组(P均<0.05)，B组高于A组(P均<0.05)。

表2 各组大鼠卵巢癌移植瘤组织PI3K、p-mTOR、PTEN相对表达量比较

注：与A组相比，#P<0.05；与B组相比，ΔP<0.05。

3 讨论

近年来随着生活环境的不断恶化和人们生活压力的增加，各种癌症的发病率不断攀升，卵巢癌的发病率、病死率也在全国范围内急剧增长[4]。尽管近几十年来随着医疗水平的发展癌症死亡人数有所下降，但卵巢癌仍然是世界范围内与癌症相关死亡的最主要原因之一。雷公藤红素是第一个从雷公藤藤本植物中提取的主要活性物质，是一种五环三萜类化合物[5，6]。研究表明雷公藤红素可抑制多种类型肿瘤生长并诱导其凋亡，有良好的抗肿瘤作用[7,8]。雷公藤红素除具有良好的抗炎功能外，还可以抑制C6 胶质瘤、黑色素瘤抗炎、人慢性髓系白血病等多种癌症恶性增殖[9～11]。但是目前雷公藤红素对卵巢癌转移瘤抑制情况的相关报道较少，且具体机制尚不明确。因此研究雷公藤红素对卵巢癌转移瘤的抑制作用及分子机制具有重要临床意义。本研究结果显示，给药后30 d各组大鼠卵巢癌转移瘤体积均大于给药前，C组大鼠卵巢癌转移瘤体积小于A、B组，B组大鼠卵巢癌转移瘤体积小于A组。说明雷公藤红素腹腔注射可抑制F344大鼠卵巢癌转移瘤生长，且效果优于传统化疗药物顺铂。

PI3K/mTOR信号通路是在肿瘤形成中起关键作用的细胞内信号通路，PI3K/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-mTOR是调节肿瘤细胞增殖、代谢、细胞周期进程、凋亡的核心蛋白[12～15]。PTEN基因是一种经典的抑癌基因，该基因编码的蛋白具有特异性磷酸酶活性，可调控细胞核生长周期来抑制肿瘤生长、转移[16～18]。本研究结果显示，给药30 d后B、C组大鼠卵巢癌转移瘤组织PI3K、p-mTOR、PTEN相对表达量与A组相比增加，且C组大于B组。因此我们推测雷公藤红素可能通过激活PI3K/mTOR信号通路，增加瘤体内PTEN表达增加来抑制大鼠卵巢癌转移瘤。但是若要进一步验证这一推测，我们仍需要进行进一步研究。

本研究的不足之处在于仅初步探讨了雷公藤红素对大鼠卵巢癌转移瘤的抑制作用及可能涉及分子机制，但是没有考虑雷公藤红素剂量浓度对于卵巢癌影响，下一步我们将研究高、中、低剂量雷公藤红素对卵巢癌抑制作用的影响。

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