甘草查尔酮A对卵巢癌细胞株HO8910增殖、凋亡的影响及其机制

仇小敏,王佳贺

(1天津医科大学总医院，天津300052;2中国医科大学附属盛京医院)

卵巢癌为中老年女性常见恶性肿瘤之一，病死率较高[1,2]。化疗是目前治疗卵巢癌的主要方案，但是卵巢癌对化疗药物的耐药及其很强的转移能力严重地降低了卵巢癌患者的生存率[3～5]。因此寻找卵巢癌耐药的分子靶点是当前研究的热点。甘草查尔酮A是甘草根部的主要活性提取物查尔酮的主要活性成分。研究发现甘草查尔酮A对多种肿瘤细胞均有抑制增殖、促进凋亡的作用[6～8]。但关于其对卵巢癌细胞的作用及可能的作用机制方面的研究目前仍较少。本研究观察了甘草查尔酮A培养的HO8910细胞增殖、凋亡情况，半胱天冬蛋白酶激活剂 (Smac)、X连锁凋亡抑制蛋白 (XIAP) 表达情况及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3) 活性的变化，探讨甘草查尔酮A对HO8910细胞增殖、凋亡的影响及其可能作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂和设备 人卵巢癌细胞株HO8910由中国医科大学中心实验室提供。细胞培养试剂和小牛血清购于美国Invitrogen公司；移液器、离心机(购自德国 Eppendorf 公司)；流式细胞仪(购自美国贝克曼公司)；XIAP、Smac、β-actin蛋白表达检测试剂盒，MTT、Annexin V FITC /PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司。Caspase-3活性检测试剂盒购于美国Santa Cruz公司。

1.2 HO8910细胞分组及 甘草查尔酮A应用 将HO8910细胞放在含10%小牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度恒温箱中培养、传代，取对数生长期细胞接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后，弃去培养液。设观察1、2、3组和对照组，每组5孔。观察1、2、3组分别加入终浓度为20、40、80 μmol/L的甘草查尔酮A，对照组只加培养液。继续培养。

1.3 各组细胞增殖情况观察 采用MTT法。继续培养24、48、72 h后收集各组细胞，弃上清，加入20 μL MTT，37℃继续孵育4 h后弃上清。每孔加入DMSO 150 μL吹打混匀，用酶标仪检测光密度值(OD值)。增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.4 各组细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术和Annexin V-FITC/PI双染法。继续培养24、48、72 h后收集各组细胞，用冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，2 000 r/min离心后收集细胞，调细胞浓度至106/mL，加入60 μL的缓冲液重悬后依次加入5 μL的Annexin V、5 μL的PI轻轻摇匀，于常温下避光15 min，用流式细胞仪测算细胞凋亡率。

1.5 各组细胞XIAP、Smac蛋白检测 采用Western blotting 法。。继续培养24、48、72 h后收集各组细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，胰酶消化，离心提取总蛋白，BCA 法测蛋白总浓度，行SDS-PAGE，300 mA转至聚偏二氟乙烯膜，然后用5%封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)室温下封闭2 h，TBST洗涤3次，每次5 min 。加入一抗(用1∶1 000 PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，每次5 min； 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶6 000稀释)，室温孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次5 min。加入显色液，避光显色至出现条带，在凝胶成相仪上照相。同时放入双蒸水中终止反应。以β-actin为内参照。以XIAP、Smac蛋白条带和β-actin条带灰度值之比表示XIAP、Smac蛋白相对表达量。

1.6 各组细胞Caspase-3活性检测 收集各组细胞并裂解，冰上孵育10 min，4 ℃下12 000 r/min离心10～15 min，收集上清液，按照Caspase-3酶活性试剂盒操作。在荧光计数仪上测定荧光的量。通过测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线计算各孔中的活细胞数。酶标仪或分光光度计(100 μL的比色皿)在405 nm或400 nm波长处测定吸光度值(OD值)，以OD诱导剂/OD对照表示观察1、2、3组Caspase-3活性。

2 结果

2.1 各组细胞OD值比较 继续培养24、48、72 h各组细胞OD值见表1。培养24 h对照组和观察1、2、3组细胞增殖抑制率分别为0、8.53%、14.14%、26.11%，培养48 h时分别为0、11.97%、18.36%、33.52%，培养72 h时分别为0、25.71%、37.62%、51.94%。相同培养时间情况下，随着甘草查尔酮A浓度的提升，细胞增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)。甘草查尔酮A浓度不变的情况下，细胞增殖抑制率随培养时间延长逐渐升高(P均<0.05)。

2.2 各组细胞凋亡率比较 继续培养24、48、72 h各组细胞凋亡率见表2。相同培养时间情况下，随着甘草查尔酮A浓度的提升，细胞凋亡率逐渐升高(P均<0.05)。甘草查尔酮A浓度不变的情况下，细胞凋亡率随培养时间延长逐渐升高(P均<0.05)。

表1 培养24、48、72 h各组细胞OD值比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表2 培养24、48、72 h各组细胞凋亡率比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 各组细胞XIAP和Smac蛋白相对表达量比较 继续培养24、48、72 h各组细胞XIAP和Smac蛋白相对表达量见表3。相同培养时间情况下，随着甘草查尔酮A浓度的提升，XIAP蛋白相对表达量逐渐降低(P均<0.05)，Smac蛋白相对表达量逐渐升高(P均<0.05)。甘草查尔酮A浓度不变的情况下，随着培养时间的延长，XIAP蛋白相对表达量逐渐降低(P均<0.05)，Smac蛋白相对表达量逐渐升高(P均<0.05)。

2.4 各组细胞Caspase-3活性比较 继续培养24、48、72 h各组细胞Caspase-3活性见表4。相同培养时间情况下，随着甘草查尔酮A浓度的提升，细胞Caspase-3活性逐渐升高(P均<0.05)。甘草查尔酮A浓度不变的情况下，细胞Caspase-3活性随培养时间延长逐渐升高(P均<0.05)。

表3 培养24、48、72 h各组细胞XIAP和Smac蛋白相对表达量比较

注：

表4 培养24、48、72 h各组细胞Caspase-3蛋白比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

卵巢癌是指来源于卵巢的恶性肿瘤，其发病率及病死率呈逐年上升的趋势[6～8]。目前临床上用于治疗卵巢癌的化疗药物不良反应大，且易产生获得性耐药，导致卵巢癌化疗失败、复发或转移常见[9,10]。因此，探索增进化疗药物的疗效、减少化疗药物不良反应的方法，是降低病死率、改善患者预后的关键[11]。甘草查尔酮A大量分布于甘草根茎中，目前研究证实其具有抗肿瘤、抗炎、抗菌及免疫调节、抗氧化等多种药理活性，其中尤以抗肿瘤作用最受关注。甘草查尔酮A抗肿瘤的机制主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡。但关于其是否能够诱导卵巢癌细胞凋亡的研究尚未见报道。本研究结果显示，甘草查尔酮A可剂量和时间依赖的抑制HO8910细胞增殖、促进HO8910细胞凋亡，填补了这一空白。

凋亡抑制蛋白(IAPs)家族是一类在结构上具有同源性的蛋白，且与肿瘤的关系密切[12]。XIAP 是IAP 家族的一员，具有抑制细胞凋亡的作用[13]。Smac是一种能够促进细胞凋亡的线粒体蛋白，主要通过与IAP 家族成员相互作用促进细胞凋亡[14～16]。XIAP是人类抑制凋亡基因家族中作用最强的成员，通过与Caspase-3结合使其丧失活性而阻止细胞凋亡[17,18]。本研究结果显示，甘草查尔酮A可以计量和时间依赖的下调XIAP蛋白、上调Smac蛋白并增强Caspase-3活性，笔者认为这可能是甘草查尔酮A可剂量和时间依赖的抑制HO8910细胞增殖、促进HO8910细胞凋亡的机制。

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