转染微小RNA125b抑制序列的三阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡变化

聂俊，江波，何文杰，朱颖，涂长玲，董坚

(云南省肿瘤医院，昆明650118)

三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)均为阴性表达的乳腺癌，约占全部乳腺癌15%～20%[1]。这类乳腺癌由于缺乏特异性靶点，内分泌治疗与抗HER-2靶向治疗无效，目前治疗以手术和放化疗为主，但疗效不佳，早期局部复发和远处转移率较高，总生存率较低，预后差[2]。微小RNA(miRNA)是一种长约22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过结合到靶基因 mRNA 的 3′非翻译区(3′UTR)，从而降解靶基因 mRNA或抑制其翻译，实现对靶基因的转录后调控，从而参与调控个体发育、细胞代谢、增殖、分化和凋亡等多种生物学过程[3]。微小RNA125b(miRNA-125b)可通过其靶基因调控Wnt[4]、NF-κB[5]、TGF-β[4]、STAT等信号通路，进而影响乳腺癌发生发展。但干扰miRNA-125b表达对TNBC细胞增殖、凋亡及相关通路蛋白表达情况影响的相关研究目前较少。本研究观察了通过转染miR-125b抑制物的方法干扰TNBC细胞中miR-125b表达对TNBC细胞MDA-MB-468增殖、凋亡和NF-κB通路蛋白的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂及仪器 人MDA-MB-468细胞购自中科院上海细胞库。补充主要试剂和仪器。10%胎牛血清购自GIBCO公司，DMEM/F12、LTX转染试剂盒购自Invitrogen公司，Trizol试剂盒、miR-125b引物、U6、miR-125b抑制物、miR-125b阴性对照物购自上海吉玛制药技术有限公司。MTT购自Signalway公司、蛋白抗体购自Millipore公司。miR-125b抑制序列为5′ -CTCACAAGTTAGGGTCTCAGGG-3′无关序列的核苷酸序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,均由上海吉玛公司合成纯化。

1.2 MDA-MB-468细胞分组及miR-125b抑制物转染 MDA-MB-468细胞用L-15培养基(美国GIBCO公司)于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天换液1次。待细胞处于对数生长期，并且融合率达90%时传代。取对数生长期MDA-MB-468细胞调节细胞密度为2×105/μL，接种于24孔板，每孔2 mL。将MDA-MB-468细胞分成miR-125b抑制序列转染组、无关序列转染组、空白对照组，每组3孔。miR-125b抑制序列转染组、无关序列转染组分别转染miR-125b抑制序列、无关序列，转染试剂均为脂质体Lipofectamine，按试剂盒说明书操作。空白对照组不转染。

1.3 三组细胞中miR-125b的检测 采用实时荧光定量PCR法检测转染48 h三组细胞miR-125b。按照Trizol试剂盒说明书提取癌组织和细胞总RNA,逆转录为cDNA,逆转录条件为25℃ 30 mim、42℃ 30 mim、85℃ 10mim，逆转录试剂由吉玛公司提供。cDNA 采用SYBR Seclect Master Mix系统进行实时荧光定量PCR检测miR-125b的表达，以U6作为内参。miR-125b正向引物5′- ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3′，反向引物5′- TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3′，U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ ，反向引物5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△ △CT表示miR-125b相对表达量。

1.4 三组细胞增殖情况观察 采用MTT法。将转染完毕的三组细胞胰酶消化后，调整细胞密度为1×105/mL，每孔100 μL含细胞5 000/孔接种于96孔板，继续培养24、48、72、96、120 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续孵育4 h后弃去培养液，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)溶液，摇床低速震荡10 min后，用酶标仪在570 mm波长处检测吸光度(OD570)，以空白培养基调零。实验重复3次。

1.5 三组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。转染72 h后，用无EDTA 的0.25%胰酶将细胞消化成单个，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，再用1×结合缓冲液制成1×106/mL的悬液。Falcon试管中加入100 μL细胞悬液，加入5 μL膜联蛋白V(Annexin V)-FITC和10 μL 碘化丙啶(PI)染料，轻轻混匀，室温下避光放置15 min，流式细胞仪测算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.6 三组细胞NF-κBp65、Caspase-3蛋白检测 采用Western blotting法。三组细胞长至80%～90%汇合时，分别提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入5×Protein Loading Buffer煮沸5 min使蛋白充分变性，-70 ℃保存。以β-actin为内参，每个泳道上样40 μg蛋白，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿转转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温封闭2 h，分别加入磷酸化的NF-κB p65、Caspase-3一抗(工作浓度1∶200)4℃孵育过夜，洗膜10 min×3次，加二抗(工作浓度1∶1 000)室温孵育2 h，电化学发光法(ECL)曝光显影。以NF-κB p65、Caspase-3蛋白条带与β-actin条带灰度值之比表示NF-κB p65、Caspase-3蛋白表达量。

2 结果

2.1 三组细胞OD570比较 转染后不同时点三组细胞OD570见表1。转染96、120 h 时miR-125b抑制序列转染组细胞OD570低于无关序列转染组和空白对照组(P均<0.05)，无关序列转染组和空白对照组OD570相比P>0.05。转染24、48、72 h三组细胞OD570相比P均>0.05。

表1 转染后不同时点三组细胞OD570比较

注：与无关序列转染组和空白对照组相比，*P<0.05。

2.2 三组细胞凋亡率比较 转染72 h后miR-125b抑制序列转染组、无关序列转染组和空白对照组细胞凋亡率分别为24.85%±2.21%、1.47%±0.78%和1.32%±0.65%。miR-125b抑制序列转染组细胞凋亡率与无关序列转染组和空白对照组相比，P均<0.05，无关序列转染组和空白对照组细胞凋亡率相比，P>0.05。

2.3 三组细胞NF-κBp65、Caspase-3相对表达量比较 三组细胞NF-κBp65、Caspase-3相对表达量见表2。与无关序列转染组和空白对照组相比，miR-125b抑制序列转染组细胞NF-κBp65相对表达量下降(P均<0.05)，Caspase-3相对表达量上升(P均<0.05)；无关序列转染组和空白对照组细胞NF-κBp65、Caspase-3相对表达量相比，P均>0.05。

表2 三组细胞NF-κBp65、Caspase-3相对表达量比较

注：与无关序列转染组和空白对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

乳腺癌是高度异质性的肿瘤，早期病理仅从形态学的差异进行区分，之后根据基因表达谱的不同，将乳腺癌分为管腔A型、管腔B型、正常乳腺样型、HER2过表达型、基底细胞样型(TNBC属于此型)5种亚型[6]，各种亚型的生物学行为不同。miRNA是非编码小分子RNA，通过对靶基因的调控参与乳腺癌的发生发展。不同乳腺癌亚型中miRNA的表达存在差异，这些差异与乳腺癌的分期、激素受体表达水平等因素相关[7]。在正常乳腺组织中，miR-125b、let7c等8个miRNAs在基底样细胞中的表达高于管腔型细胞， miR-200c、miR-21等6个miRNAs在管腔型细胞中表达高于基底样细胞，这些在管腔型和基底样型细胞间差异表达的miRNAs被称为管腔型细胞特异性miRNA和基底样细胞特异性miRNA[8]。在乳腺癌中，所有基底样细胞特异性miRNA在管腔型中表达较低，而miR-125b在具有BRCA-1突变的基底样乳腺癌和肌上皮样肿瘤中均高表达[8]。已有研究表明，miR-125b异常表达可通过调节p53、NF-κB等信号通路活性，发挥促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡。但尚未见有关TNBC的类似研究。本研究结果显示，转染miR-125b抑制物的TNBC细胞MDA-MB-468内miR-125b的表达下降、增殖活性降低、凋亡率升高，表明表明miR-125b参与TNBC细胞增殖和凋亡的调控。miR-125b可能是诊治TNBC的靶点。

NF-κB是一种具有多向调节功能的转录因子，通过调控下游基因的表达影响细胞的增殖、炎症反应、侵袭和凋亡，在恶性肿瘤的发展中具有重要作用。在静息状况下，NF-κB连接在IκBs蛋白亚基上，以无活性的形式存于细胞质内。被激活后，NF-κB从抑制亚单位上释放，导致IκB-α被磷酸化并降解，NF-κB p65亚单位转位到细胞核内，调节靶基因的表达。NF-κB在TNBC中持续激活，参与TNBC增殖[9]、转移，并抑制细胞凋亡[10]。NF-κB激活后，可通过上调抗凋亡基因FLIP、凋亡抑制蛋白c-IAP1/2和XIAP以及Bcl-2家族成员的表达[11]，下调Bax、Fas、Bak等促凋亡蛋白的表达，抑制Caspase3 的活性，减少肿瘤细胞的凋亡[12]。因此，抑制NF-κB的活性可能是治疗TNBC的方法。

研究表明，在包括乳腺癌在内的许多恶性肿瘤中，NF-κB信号通路活性与miRNA有关，如miR-223通过激活NF-κB促进肺癌的发展[13]，而miR-429通过靶向IKKβ，抑制NF-κB通路的活性，使宫颈癌细胞的生长受抑[14]。多个miR-125b的靶基因参与NF-κB信号通路的调节。miR-125b在胶质母细胞瘤中过表达，可通过抑制其靶基因NF-κB负性调节因子NKIRAS2 和TNFAIP3的表达，增强NF-κB信号通路的活性，促进肿瘤细胞的增殖，抑制细胞凋亡并产生耐药[5]。miR-125b在鼻咽癌中高表达，通过作用于靶基因A20激活NF-κB通路，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[15]。此外，miR-125b的一些靶基因是p53的上游调控因子，并且miR-125b可直接下调p53，从而抑制肿瘤细胞凋亡作用。本研究结果显示，转染miR-125b抑制物后TNBC细胞MDA-MB-468内NF-κBp65表达量下降，表明在TNBC中miR-125b可参与NF-κB活性的调节。抑制细胞内miR-125b的表达引起的细胞增殖能力下降和凋亡率增加，可能与NF-κB通路活性受抑制有关。调控miR-125b表达可能通过NF-κB通路对TNBC发挥治疗作用，这可以作为进一步研究的方向。

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