不同基质溶液与渗透压对PEG沉淀血清循环免疫复合物的影响*

徐国萍，成 军，孙长贵，戴玉柱

(1.杭州江干区人民医院检验科，杭州 310016；2.解放军第一一七医院检验科，杭州 310013)

血清循环免疫复合物(circulating immune complex，CIC)在多种疾病的发生、发展中起到了非常关键的作用，因此临床实验室出现了大批关于CIC检测的方法[1～3]。依据检测方法的特异性，将CIC检测方法分为特异性方法和非特异性方法两大类[4～6]。而聚乙二醇(PEG)沉淀法既可用于非特异性的方法检测(分光光度计检测吸光度)，也可用于特异性方法的前处理(CIC浓缩或CIC与血清基质分离)。PEG为一种不带电荷的直链大分子多糖，主要通过促进CIC聚合成更大的凝聚物而使之被沉淀，PEG沉淀法因方法简便、快速、重复性好，在临床实验室被广泛用于病原体及血清CIC的分离与浓缩。国内外的文献均对PEG沉淀法的温度、离心力、时间等要素进行了优化和明确[5，7]，但PEG沉淀法所用溶液基质、离子强度以及渗透压的选择对沉淀效果的影响，则未见相关报道。本文在PEG沉淀法常见的影响因素下，结合我们自主研发的特异性免疫复合物缓冲解离技术，提出了溶液基质、离子强度及渗透压对PEG沉淀法分离血清CIC的影响。具体如下：

1材料与方法

1.1 标本来源 335份五种乙肝血清标志物模式(HBV-M)标本来自于健康体检者、本院住院传染病科、浙江大学附属第一医院传染病中心住院病人，其中100份HBV-M-1标本(健康体检者，阴性对照组)：HBsAg，anti-HBs，HBeAg，anti-HBe，anti-HBc均阴性；42份HBV-M-2标本：HBsAg，HBeAg和anti-HBc阳性，117份HBV-M-3标本：HBsAg，anti-HBe和anti-HBc阳性；30份HBV-M-4标本：HBsAg，anti-HBc阳性；46份HBV-M-5标本：anti-HBs，anti-HBe，anti-HBc阳性。

1.2 试剂和仪器 制备HBsAg-anti-HBsAg免疫复合物(HBsAg-CIC)，其中HBsAg纯化抗原(3.0 mg/ml)购于以色列Prospec公司；羊-抗HBsAg多克隆抗体(3.0 mg/ml)购于北京博奥森生物技术有限公司；聚乙二醇(PEG 6000)、硼酸(H3BO3)、硼砂(Na2B4O7)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、氯化钠(NaCl)、氟化钠(NaF)购置于成都科龙化工；巴比妥钠(C8H11N2NaO3)购于华中海威基因有限公司；浓盐酸(HCl)购于兰溪六洞山化工。上海精宏DK-8D型水浴箱，上海精科UV-721型分光光度计，德国原装赛多利PP-50型pH计，德国艾卡C-MAG HS型磁力混匀器，德国艾本德5804 R型高速离心机，德国高能泰克osmomat 030型冰点渗透压仪，美国雅培诊断i2000型化学发光免疫分析仪及配套HBsAg检测试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 HBsAg-抗HBsAg免疫复合物制备：在美国雅培公司i2000化学发光免疫分析仪及配套HBsAg试剂检测在线性范围内按照合适的比例配制HBsAg-CIC，用HBV-M均阴性的混合人献血员血清作为稀释剂稀释纯化的人血HBsAg至200 IU/ml(制备的HBsAg量)，然后加入羊抗-HBsAg多克隆抗体直至游离HBsAg检测结果<1.5 IU/ml，游离抗体<15 IU/ml为止，37℃水箱放置2 h，然后放4℃冰箱过夜，即形成稳定的HBsAg-CIC，精确计算HBsAg终浓度为193.6 IU/ml，每升复合物制备溶液中加入0.2 ml proclin 300生物防腐剂后分装4℃保存备用。

1.3.2 免疫复合物分离：依据参考文献[5]选择70 g/L PEG 6000沉淀剂，4℃沉淀24 h，离心力为18 009×g离心10 min，对不同基质溶液、离子强度及渗透压进行多因素正交设计分组，各基质溶液的配置依据专利及参考文献[5，8，9]。①基质溶液浓度：0.10 mol/L，0.15 mol/L，0.20 mol/L；②不同基质溶液：硼酸盐缓冲液(BB)、磷酸盐缓冲液(PBS)、巴比妥钠-HCl缓冲液(Barbital -HCl)，Tris-HCl缓冲液；③基质溶液渗透压：400 mOsm/kg，500 mOsm/kg，600 mOsm/kg，700 mOsm/kg；④基质溶液pH值：7.8，8.0，8.2，8.4。

1.3.3 免疫复合物传统法(传统PEG沉淀法)[10]与改良法[5](优化后的PEG沉淀分离法)的分离结果比较：传统法和改良法分离待测样本HBsAg-CIC沉淀各两份分别设空白管(未解离HBsAg测定值)和测定管(解离后HBsAg测定值)。分离后沉淀，按照我们自主研发的专利技术[8，9](专利号：ZL201410034039.5，ZL201410033277.4)对分离出的CIC进行解离，解离后使用化学发光定量检测游离HBsAg量，来计算免疫复合物量即解离率。空白对照管未解离的游离HBsAg测定：向空白对照管中同时加入CIC抗原缓冲解离剂和CIC抗原缓冲解离中和剂，混匀后采用Abbott i2000分析仪及配套试剂检测HBsAg，其结果作为空白值；测定管解离后的总游离HBsAg测定：向测定管中加入抗原缓冲解离剂，置42℃水浴振荡30 min(振荡频率60次/min)；抗原缓冲解离中和剂，混匀后采用Abbott i2000分析仪及配套试剂2 h内检测HBsAg，其结果作为测定值(HBsAg-CIC=测定管HBsAg测定值-空白管HBsAg空白值)。

1.4 结果判断 HBsAg-CIC结果判断标准见表1。

表1 解离测定CIC中抗原结果判断标准

注：*Abbott i2000免疫分析仪的HBsAg Cutoff=0.05 IU/ml。

2结果

2.1 PEG沉淀法中不同基质、浓度、pH值、渗透压条件优化 见表2。通过采用正交设计对PEG各影响因素的优化比较发现：在这已知四个影响因素中，按照其对沉淀效果的影响大小依次为：溶液渗透压>基质溶液种类>溶液pH值>溶液浓度，通过四因素四水平的比较，得到PEG优化后改良法的最佳分离溶液体系：0.15 mol/L，pH 8.2，500 mOsm/kg的硼酸盐缓冲液含70 g/L PEG6000。

表2 不同基质、浓度、pH值、渗透压条件优化正交设计结果

注：表中加下划线数据为该因素中分离效果最佳的水平。

2.2 传统法与改良法分离结果比较 见图1。通过将传统法与改良法的前处理结果进行比较可知：在乙肝感染不同的HBV-M中，HBV-M2模式中的HBsAg-CIC阳性率最高，其次为HBV-M3模式，HBV-M1的HBsAg-CIC阳性率最低；图中乙肝各模式下经改良法前处理的HBsAg-CIC检出率明显高于传统法，其中HBV-M1为不存在HBsAg-CIC，所以两者无可比性。

由表3可知：改良法和传统法同时运用在乙肝不同模式下，改良法沉淀的HBsAg-CIC的量高于传统法，且在HBV-M 2，3，4中差异存在统计学意义(t=-5.66，-12.60，均P<0.05)，另外在HBV-M 1，5模式中，两者差异无统计学意义(t=-0.775～-1.77，均P>0.05)。

表3 不同HBV-M模式采用传统法与改良法的分离HBsAg含量比较

注：HBV-M-1：HBsAg，anti-HBs，HBeAg，anti-HBe，anti-HBc均阴性；HBV-M-2：HBsAg，HbeAg，anti-HBc阳性；HBV-M-3：HBsAg，anti-HBe，anti-HBc阳性；HBV-M-4：HBsAg，anti-HBc阳性；HBV-M-5：anti-HBs，anti-HBe，anti-HBc阳性。

图1 不同HBV-M模式采用传统法与改良法HBsAg-CIC阳性率(%)

3讨论抗原进入机体或自身抗原刺激(抗原变性、隐蔽性抗原释放)，能诱发机体产生细胞及体液免疫应答，产生大量针对相关抗原的抗体，致使抗原与抗体形成免疫复合物[1～3]。部分抗原形成免疫复合物被清除，但在某些情况下，当抗原在体内持续存在或者机体清除抗原抗体复合物的功能受损时，免疫复合物可在机体的特定部位引起损害，导致急性炎症、慢性炎症、甚至变性坏死[11]。乙型肝炎在我国病毒性肝病中，患病比例最高，而且多数处于慢性化，病毒长期与宿主共存，难以完全清除，其中HBsAg-CIC在乙型肝炎引起肝病发生、发展中具有重要的作用[12，13]。PEG沉淀法检测免疫复合物，因其敏感度及特异度问题，在目前实验室逐渐被抗抗体法、补体法等相对特异的方法所取代。而PEG沉淀CIC法，在临床及基础实验室仍然被广泛用于各类CIC的分离及病原体核酸浓缩。本文围绕PEG沉淀法分离血清HBsAg-CIC这一主题，对该分离方法的实验过程进行优化，以提高分离效果。

由表2可知，除了PEG的浓度、沉淀时间以及离心力外，本文讨论的沉淀分离所受影响因素，其重要性依次为：渗透压>基质溶液>pH值>浓度，其中渗透压为主要因素，提示适当的提高渗透压有助于免疫复合物的有效分离，过高或者过低则影响CIC的分离。分析原因：适当的高压减少CIC处于悬浮状态，并且可使CIC的空间结构发生改变有利于CIC分离。当渗透压过低时，悬浮状态CIC过多导致最后的沉淀离心，无法将CIC沉淀完全。当渗透压过高时，CIC及其内部的抗体空间结构发生严重的改变，致使用其他特异性方法去检测时，CIC中的检测位点无法充分暴露，反而降低了检测效果致使检测能力下降。其次是基质溶液，我们在选择不同的基质时存在明显的差异，其中BB缓冲液与PBS缓冲液差异小，而使用巴比妥缓冲液与Tris-HCl作为基质溶液分离效果明显下降，这可能是不同的基质体系，即使是pH值一致，可其内部的缓冲离子量不同，导致分离效果存在差异。pH值单独作为影响因素和不同基质溶液是分不开的，不同的pH值在某种程度上也就决定了其缓冲能力的大小。溶液浓度影响最小，本文研究的均为缓冲体系，所以在一定的浓度范围内变化，基质溶液仍然呈现缓冲体系。

由表3和图1可知在乙肝不同模式下，HBsAg-CIC的阳性率不同，其中阳性率最高的是HBV-M2(HBsAg，HbeAg，anti-HBc阳性)，最低的是HBV-M1 (HBsAg，anti-HBs，HBeAg，anti-HBe，anti-HBc均阴性)，改良法的阳性率要高于传统法，另外改良法(HBV-M 2，3，4)分离的HBsAg-CIC量要高于传统法，且差异具有统计学意义(P<0.05)，在HBV-M5中因为本研究收集的样本例数少，所以差异未能比较出统计学意义(P>0.05)，由此说明在HBV疾病发生发展的不同阶段其HBsAg-CIC含量不尽相同，其形成机制和致病机理还不十分明确，有待下一步研究证明。

综上所述，PEG沉淀免疫复合物法，不仅要考虑到PEG浓度、离心力以及放置时间的因素，同时要考虑基质溶液渗透压、基质溶液种类、不同pH值和基质溶液浓度等因素。改良法PEG沉淀效果明显优于传统方法，为进一步研究HBsAg-CIC在HBV感染不同阶段的致病机理提供了一个可靠的技术手段，同时对于各类病原体或自身抗原所致疾病中形成的CIC研究工作提供了新思路。

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