副猪嗜血杆菌的分离鉴定及中药单体抑菌作用

(福建光华农牧科技开发有限公司，福建 福州 350000)

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起的猪多发性浆膜炎和关节炎[1]。目前H.parasuis在世界范围内广泛流行，给规模化猪场的生产造成了巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌属于巴士杆菌科，NAD依赖型、兼性厌氧性、革兰氏阴性细小杆菌、非溶血性、V因子依赖性、形态多变、无芽孢，是一种条件性致病菌，广泛存在于猪的呼吸道[2]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1病料 福建省福州市某猪场的病猪关节液病料。

1.1.2主要试剂及培养基 胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (TSA)、新生牛血清、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)、二甲基亚砜(DMSO)、Premix Taq、DNAmarker、琼脂糖、TAE缓冲液、14种中药单体标准品等。

1.2方法

1.2.1细菌的分离 在超洁净工作台中取出病料，点燃酒精棉球对病料的表面进行火焰灭菌，切开关节腔，用灭菌的接种棒深入关节腔内采集关节液，划线于事先配制的TSA培养基上，37℃恒温培养。

1.2.2细菌的纯化H.parasuis在含有NAD+及新生牛血清的TSA培养基上生长良好，培养24 h以后用接种棒挑选疑似H.parasuis的单菌落，在新的TSA平板上划线纯化，37℃培养。24 h以后再挑选长势良好的疑似H.parasuis的单菌落，接种到5 mL的TSB液体培养基中，放入恒温摇床，37℃、190 rpm振荡培养12 h后分装保存，等待下一步的验证。

1.2.3细菌DNA的提取 取1 mL事先保存的细菌培养液于1.5 mL离心管中，10000 rpm离心5 min，弃去上清液，加入500 μL的ddH2O，100℃煮沸10 min。再放入冰块中冰浴5 min，10000 rpm离心5 min，取上清液装入新的EP管内，-20℃保存备用。

1.2.4PCR鉴定 取疑似副猪嗜血杆菌菌液，作为PCR模板，在25 μL反应体系中加入Premix Taq 12.5 μL，模板DNA 1 μL，引物1.5 μL(P1、P2、P3各0.5 μL)，ddH2O 10 μL，瞬时离心混匀。然后在PCR仪中运行以下程序：95℃预变性5 min；94℃变性45 s；56℃退火45 s；72℃延伸50 s 35个循环，72℃延伸10 min。将PCR的产物点样于1%琼脂糖凝胶孔中，120 V、120 A电泳20 min后，置于凝胶成像仪中观察，并做好记录。

1.2.5各种中药对H.parasuis的最小抑菌浓度(MIC)测定 用高压灭菌的10 μL枪头挑取长势良好的单菌落，转接至TSB液体培养基中，37℃、190 rpm振荡过夜培养。利用紫外分光光度计测量菌液OD600处的吸光度。用TSB肉汤稀释，将菌液的吸光度值调节0.5个麦氏比浊。在使用前，再将菌液稀释10倍(菌液浓度为1×107CFU/mL)。在无菌条件下，向96孔板的第一列加入190 μL TSB液体培养基,其他各孔加入100 μL TSB液体培养基。然后往第一列中分别加入10 μL浓度为5120 μg/mL的药品储备液，使其终浓度为256 μg/mL。吹打混匀以后，从第一列吸取100 μL液体到第二列中，再次吹打混匀，这样依次倍比稀释至第10号孔，吹打混匀后弃去100 μL液体。第11和第12号孔暂不做处理。盖上盖子后放入37℃恒温箱中培养。分别在培养12 h和24 h时取出试管，在无菌条件下用接种环取一些菌液在TBA固体培养基上划线，再放入恒温箱中培养48 h。观察细菌是否生长，以细菌不生长的最小浓度作为最小杀菌浓度。

2 结果

2.1细菌菌落形态 从临床采集病料中分离到的H.parasuis菌株，经过纯化后的菌株在含有新生牛血清和NAD+的TSA琼脂平板上呈现为光滑湿润，透明或者灰白色、露珠或者针尖状大小的菌落。如图1所示。

图1 副猪嗜血杆菌形态

2.2PCR鉴定结果 根据H.parasuis的16S rRNA基因的保守序列设计引物，将分离到的疑似H.parasuis的菌株进行PCR扩增，所得产物的大小为1028 bp。结果证明所分离到菌株有4株为H.parasuis。

M：DL2000 DNAmarker；阳性：阳性对照；1、2、3、4：检测样品。图2 16S rRNA凝胶电泳图

2.3中药单体对H.parasuis分离株的最小抑菌浓度(MIC) 14种中药单体对H.parasuis的最小抑菌浓度结果如表1。

3 讨论

近年来，猪群对抗生素的依赖性不断增加，研究发现已经出现对青霉素、氨苄西林、头孢菌素、庆大霉素、壮观霉素、氟甲砜霉素、增效磺胺、硫化酰胺及氟喹诺酮类耐药的H.parasuis，大量菌株对四环素、红霉素、氨基糖苷类和林可霉素有明显的抵抗力。随着对中药研究的深入， 大量的报道显示许多中药具有抑菌杀菌的作用，且没有出现耐药的情况。中药的成分多种多样，中药的活性物质也多种多样，因此其抑菌杀菌的机制也更加全面[4-5]。本次试验表明，以盐酸小檗碱抑菌效果最好，MIC为16 μg/mL，大多维持在64-128 μg/mL之间。许多不具备抑菌作用的中药，对病原菌依旧有效。无残留且不易产生耐药性的中药，有潜力成为新型的抗生素。

表1 14种中药单体对H.parasuis的最小抑菌浓度结果

[1] 郭蕊.副猪嗜血杆菌病细菌分离及PCR检测方法的建立与应用[J].今日畜牧兽医,2015(5):26-28.

[2] 范国英,刘俊伟,王顺岗,等.副猪嗜血杆菌病的诊断与治疗试验[J].黑龙江畜牧兽医,2011(12):82-83.

[3] Head N E, Yu H.Cross-sectional analysis of clinical and environmental isolates of pseudomonas aeruginosa: Biofilm formation, virulence and genome diversity [J]. Infect Immun, 2004,72(1):133-144.

[4] 傅若秋,卢来春,李卓恒,等.31种中药单体对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌作用研究[J].中国药业,2014,23(4):20-22.

[5] 范国英,刘俊伟,王顺岗,等.副猪嗜血杆菌病的诊断与治疗试验[J].黑龙江畜牧兽医,2011(12):82-83.