产叶酸乳酸菌的筛选及对发酵乳的影响

曹 佩,陈杉杉,王文文,潘道东,2,吴 振,*,曾小群

(1.宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室,浙江宁波 315211; 2.南京师范大学食品科学与营养系,江苏南京 210097)

乳酸菌作为人体肠道一类重要的益生菌,具有调整肠道菌群平衡,促进营养成分吸收,提高免疫力,预防和抑制肿瘤发生,缓解乳糖不耐症,降解胆固醇等作用[19-20]。且其分解代谢可以产生供机体生长的多种维生素,如叶酸。Crittenden等[21]利用微生物法测定32株乳酸菌在发酵乳发酵过程中产生叶酸的能力,发现嗜热链球菌具有高产叶酸的能力,且采用双歧杆菌与嗜热链球菌复配发酵脱脂乳时,其产生的叶酸浓度可提高6倍。荷兰的Wegkamp等[22-23]利用基因工程手段定向改造乳酸乳球菌,提高其产叶酸能力。Wilbert等[24]利用HPLC法来筛选能产叶酸的乳酸菌,结果发现相比球菌的产叶酸能力,乳酸杆菌中的植物乳杆菌具有产叶酸的能力。由此可见,乳酸菌是生物合成叶酸最好的选择。但现有的研究致力于检测乳酸菌产叶酸的能力,而对将产叶酸的乳酸菌发酵酸奶并研究其对发酵乳的影响这方面研究较少。

本文通过高效液相色谱法从本实验室已有的5株乳酸菌中筛选出高产叶酸的乳酸杆菌,并且将高产叶酸菌株以不同比例与基础菌复合发酵,从发酵乳的质构,理化性质及感官特性等方面探索高产叶酸菌株对发酵乳品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌 宁波大学农畜产品加工实验室提供;MRS培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司;氨水、十二水合磷酸氢二钾、二水合磷酸二氢钾、氯化钠(均为分析纯)、甲醇(色谱纯) 均购于国药集团化学试剂有限公司;叶酸标准品(色谱级) 阿拉丁试剂上海有限公司;胰酶 美国Sigma公司。

安捷伦1260型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;Infinite M200 PRO型光栅型多功能酶标仪 瑞士TECAN公司;YXQ-LS-100SII型立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;FJL型发酵乳发酵柜 烟台凯达电器有限公司;5804 R型离心机 艾本德中国有限公司;AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 江苏苏州净化设制有限公司;QHZ-12A组合式恒温振荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂;FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SMSTA.XTPlus41720型质构仪 英国Stable Micro System公司;UL 40BC型乳成分分析仪 杭州浙大优创科技有限公司;水相针式过滤器 美国Millipore公司;移液枪 美国赛默飞公司。

1.2 培养基与主要试剂的配制

MRS培养基:准确称量52.24 g MRS肉汤,加热溶解于1000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min,备用。

0.5%生理盐水:量取5 mL的氨水于烧杯中,用少量去离子水溶解,转移到1000 mL容量瓶中,并用去离子水定容至1000 mL,摇匀,备用。

0.5%的氨水:量取0.5 mL的氨水于烧杯中,用少量去离子水溶解,转移到100 mL容量瓶中,并用去离子水定容至100 mL,摇匀,备用。

0.1 mol/L pH为7.2的PBS溶液:先准确称取17.9 g的K2HPO4·12H2O,用去离子水定容至500 mL容量瓶;再称取7.8 g二水合磷酸二氢钾,用去离子水定容至500 mL容量瓶;将两者混匀,将pH调至7.2。

1.3 乳酸菌产叶酸能力的测定

1.3.1 样品处理 根据徐玲燕[14]等人方法作出部分修改,将植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌以1%的接种量接种活化后,再以3%的量接入100 mL的MRS培养基进行扩大培养,于37 ℃下培养至稳定期。将培养好的发酵液以8000 r/min离心5 min后,分别取4 mL发酵液并同时加入1 mL胰酶于10 mL离心管中,做样本对照,静置2 h,使胰酶充分将发酵液中的蛋白类物质进行酶解完全。酶解后,以8000 r/min离心5 min,去沉淀,分别加入0.1 mL 0.5%提前配制好的氨水,溶解后用0.22 μm的滤膜过滤,避光待用。

1.3.2 标曲的配制 准确称量20 mg叶酸标准品,加入10 mL 0.5%的氨水助溶并用去离子水定容至50 mL,制得浓度为0.4 mg·mL-1的叶酸标准储备液。再从中取出1 mL,将其稀释至100 mL,制得浓度为0.004 mg/mL,即4 μg/mL的叶酸标准中间液。最后从中间液中分别准确吸取1、2、4、6、8、9 mL,用去离子水定容至10 mL,制得浓度分别为0.4、0.8、1.6、2.4、3.2和3.6 μg/mL的叶酸标准工作液。用0.22 μm的滤膜过滤,避光待用。

1.3.3 色谱条件 通过全波长扫描及梯度洗脱得出最佳色谱条件为:流动相∶甲醇∶PBS(0.1 mol,pH=7.2)=7∶1∶2;色谱柱:EclipseXDB-C18,5 μm,4.6×150 mm。柱温:30 ℃;检测波长:280 nm流量:1 mL/min。

1.3.4 标曲绘制及不同菌产叶酸量的测定 利用高效液相色谱法测定叶酸标准样品绘制标准曲线后对处理好的样品进行叶酸含量测定。乳酸菌产叶酸量按以下公式计算:

产叶酸量(μg/mL)=x-x0

式中：x表示发酵液中总叶酸含量,x0表示空白组中叶酸含量,μg/mL。x与x0根据标准曲线计算公式(见2.1.1)得出。

1.4 产叶酸乳酸菌对发酵乳的影响探究

1.4.1 发酵乳的制备 纯牛奶→接入6%的不同菌种比例(见表1)的乳酸菌,43 ℃下发酵7 h(母发酵剂)→按20%的接种量接入母发酵剂,加糖量为3%,于43 ℃下发酵7 h(中间发酵剂)→按20%的接种量接入中间发酵剂,于43 ℃下发酵7 h(工作发酵剂)→按20%的接种量接入工作发酵剂,于43 ℃下发酵7 h→于4 ℃后熟24 h→酸奶[25-26]。

表1 母发酵剂中菌种比例Table 1 Ratio of bacteria in starter cultures

1.4.2 发酵乳样品pH的测定 实验样品从冰箱取出后使其表面温度升至20 ℃,采用精密pH计测量其酸度变化[27]。

1.4.3 发酵乳样品持水力的测定 在离心管中各加入质量为10 g的酸奶样品,4 ℃,3000 r/min离心10 min,静置,弃去上清液,称其剩余质量为W,则其持水力的计算公式为:持水力(%)=W/10×100[28-29]

1.4.4 发酵乳的质构测定 采用英国SMSTA.XTPlus41720质构仪对酸奶样品的硬度,粘性,内聚性,胶粘性等质构特性进行测定。测定条件:采用直径为3.5 cm的圆盘形探头,探头型号为A/BE,测试速率为1 mm/s,探头下降距离为30 mm。其中硬度是指第一次穿冲样品中的压力峰值。粘性是模拟表示在探头与样品接触时用以克服两者表面间吸引力所必需的工作,是第一次穿刺的负面积。内聚性是模拟样品内部粘合力,是样品经第一次压缩变形后所表现出来的对第二次压缩的相对抵抗能力。胶粘性是用来模拟表示将半固体样品破裂成吞咽时的稳定状态所需的能量[30]。

1.4.5 发酵乳感官评定 邀请10名具有一定经验的人员组成感官评定小组,根据感官评定标准从外观组织形态、口感、滋气香味三方面对产品进行打分,采用九分制评分方法[31],评分细则如表2所示。

表2 酸奶感官评定评分标准(分)Table 2 Criteria for sensory evaluation of yogurt(score)

1.5 数据处理与统计分析

上述每组样品做三个重复,采用SAS 8.0统计软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,差异显著水平为p<0.05,极显著水平为p<0.01。采用Origin 8.0软件和Excel软件进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 产叶酸乳酸菌的筛选结果

2.1.1 标准曲线的绘制 利用高效液相色谱法,根据上述色谱条件,以叶酸标样浓度为横坐标x,峰面积为纵坐标y,得其回归方程为:y=37.642x+7.5527,R2=0.9962。

2.1.2 不同菌株产叶酸结果分析 利用高效液相色谱法测定5株乳酸菌发酵液中叶酸含量,结果如表3所示:植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌具有较好的叶酸生成能力,这与Wilbert、Rossi以及Hugenschmidt 等研究结果一致。Wilbert[24]等研究表明乳球乳酸菌能够合成叶酸,而乳杆菌属中也有少量能够合成叶酸,如植物乳杆菌。Rossi等[32]也认为野生乳杆菌属有少数可以产叶酸的菌株。而Hugenschmidt 等[33]的研究证明Lb.plantarum SM39是高产叶酸的菌株。本研究中,植物乳杆菌以及嗜酸乳杆菌均属于高产叶酸的乳杆菌,植物乳杆菌发酵液中的叶酸含量为51.40 μg/mL,嗜酸乳杆菌发酵液中的叶酸含量为34.77 μg/mL。说明植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌中含有合成叶酸必要的基因,而其他乳酸菌中不含或者缺失部分合成叶酸的基因,从而导致乳酸菌无法合成叶酸。

表3 不同菌株产叶酸量Table 3 The production of folic acid from different strains

2.2 产叶酸乳酸菌对发酵乳pH的影响结果

不同组发酵乳的pH检测结果如图1所示。

图1 产叶酸乳酸菌对酵乳pH的影响Fig.1 Effect of folic acid lactic acid bacteria on the pH of fermented milk注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

由图1可看出:组别1为对照组,其pH最高,而组别2至组别7为添加不同比例产叶酸的菌种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵的酸奶,测得酸奶的pH均比对照组要低。通过SAS 8.0软件分析得出p>0.05,说明添加一种高产叶酸的乳杆菌后,与对照组比较,发酵乳pH会下降,但差异不显著,但是添加两种产叶酸的乳杆菌的发酵乳与对照组比,pH下降明显,差异显著。说明高产叶酸乳杆菌有较好的产酸性能,当两种产叶酸乳杆菌混合发酵时,产酸效果更好,可能由于产叶酸乳杆菌发酵时产生的叶酸能够促进乳酸菌活力,从而使pH下降。pH的降低还可能由于制作发酵剂时添加的菌种比例不同,菌的活性强弱不同引起。

2.3 产叶酸乳酸菌对发酵乳持水力的影响

不同组发酵乳的持水力检测结果如图2所示。

图2 不同发酵剂对发酵乳持水力的影响Fig.2 Effect of different starter cultures on the water-holding capacity of fermented milk注：不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。

持水力表示的是发酵乳在经过离心处理后所能保留的水分,多数是能与凝胶分子结合较牢的水分,可以较大程度的影响发酵乳的风味和组织形态,受总固形物和总蛋白含量的影响。卫晓英等[34]研究表明,酸乳持水力对酸乳质构包括黏度、硬度、黏聚度等产生影响,从而改变酸乳品质。由图2可知,发酵乳的持水力在添加了产叶酸的菌株后,其值有所下降。通过SAS 8.0分析得出p<0.01,即添加产叶酸菌种对发酵乳的持水力有极显著影响,可能由于产叶酸乳酸菌引起发酵乳中产生了更多由蛋白质网络结构的毛细血管束缚着的自由水,使发酵乳在发酵期间有乳清析出的现象,发酵乳的组织状态不好,粘黏性较差[35]。

2.4 产叶酸乳酸菌对发酵乳质构特性的影响

利用质构仪从硬度,胶黏性,内聚性和黏性角度对发酵乳的质构特性进行检测,结果如表4所示。

表4 不同发酵剂对发酵乳质构的影响Table 4 Effects of different starter cultures on texture of fermented milk

发酵乳的质构特性是发酵乳感官评价一些指标的数据体现,是对发酵乳的客观评价,其不仅体现在口感方面,更能说明发酵乳质量的稳定性[36]。而不同发酵乳质构的变化,是因为发酵剂中菌株影响了发酵剂的凝胶过程中与酪蛋白分子相互作用,进而影响到酪蛋白的相互聚集作用,从而引起了质构特性的变化[27]。由表4可以看出:实验组发酵乳质构与对照组相比发生变化。通过SAS 8.0分析得出:各实验组与对照组的发酵乳在硬度、胶黏性、内聚性、黏性上有极显著差异,p<0.01,且实验组优于对照组。实验组6的硬度、胶黏性、内聚性、黏性均高于其他组。实验组4的硬度、黏性均低于其他实验组。说明添加了产叶酸乳杆菌对发酵乳质构有较好影响,而添加两种产叶酸乳杆菌对发酵乳质构的影响优于添加一种产叶酸乳杆菌。可能是因为添加产叶酸乳杆菌导致发酵乳pH下降,使酪蛋白粒子相互聚集形成较为紧密的结构,从而使发酵乳的硬度,胶黏性明显提高。

2.5 产叶酸发酵乳对发酵乳感官的影响

品评员分别从外观、口感、滋气味三方面对七种不同菌种复配发酵剂发酵的酸奶进行感官评价,结果如图3所示。

图3 不同发酵剂的感官评价图Fig.3 Sensory evaluation of different starter cultures

由图3可知,实验组发酵乳在感官评价上与对照组也有差异。从结果可以看出实验组的表面稠度,酸度,光滑度较对照组更好,而发酵乳的感官和质构,持水力及pH有一定的联系,可能由于添加产叶酸乳杆菌对发酵乳的硬度,胶黏性,内聚性及黏性有所改善,从而使发酵乳的表面稠度和光滑度提高。而添加产叶酸的乳杆菌会降低发酵乳的pH,从而使发酵乳的酸度优于对照组。

3 结论

开发叶酸强化食品是解决叶酸缺乏症的重要发展方向。采用高效液相色谱法快速检测5株乳酸菌发酵液中叶酸含量,证实了植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌有很好的产叶酸能力。其中,植物乳杆菌的叶酸浓度为51.40 μg/mL,嗜酸乳杆菌的叶酸浓度为34.77 μg/mL。进一步利用该2株乳酸菌与基础发酵剂混合发酵酸乳,通过检测发酵乳的理化指标以及数据分析,发现产叶酸乳酸菌对发酵乳的质构,酸度等都有很好的改善作用,当两种产叶酸乳杆菌共同发酵时,效果更好。但是添加产叶酸乳杆菌会使发酵乳的持水力有所下降,后续研究可以通过调整发酵温度等条件来改善发酵乳的持水力。该研究为开发富含叶酸发酵乳提供了一定的理论依据。

[1]Doherty R F,Beecher G R. A method for the analysis of natural and synthetic folate in foods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(2):354-361.

[2]马俊. 甜菜碱、叶酸的降血脂、抗氧化作用及对血管内皮细胞的氧化损伤修复功能[D]. 沈阳:辽宁大学,2016.

[3]赵宏飞. 产叶酸乳酸菌的筛选及生物学特性研究[D]. 保定:河北农业大学,2009.

[4]Lee S J,Quach C H T,Jung K H,et al. Oxidized low-density lipoprotein stimulates macrophage 18F-FDG uptake via hypoxia-inducible factor-1αactivation through Nox2-dependent reactive oxygen species generation[J]. Journal of Nuclear Medicine,2014,55(10):1699-1705.

[5]Chen X C,Wang Y,Xu R X,et al. The multiple vitamin status of Chinese pregnant women with anemia and nonanemia in the last trimester[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology,2004,50(2):87-92.

[6]Duthie SJ,Narayanan S,Brand GM,et al. Impact of folate deficiency on DNA stability[J]. Journal of Nutrition,2002,132(8 Suppl):2444S-2449S

[7]李雄彪,马庆英,崔云龙. 叶酸在肠道疾病防治中的作用[J]. 中国微生态学杂志,2007,19(2):238-240.

[8]Zhu SS,Mason J,Shi Y. The interventional effect of folic acid on the development of gastric and other gastrointestinal cancers─clinical trial and follow-up for seven years[J]. Chinese Journal of Gastroenterology,2002,7(2):73-78.

[9]Yang YB,Tan YB,Mao XX,et al. Effect of folate on prevention and treatment of cardiovascular diseases[J]. Chinese Journal of Clinical Nutrition,2006,14(2):136-139.

[10]Eliezar J,Scarano W,Boase NR,et al.Invivoevaluation of folate decorated cross-linked micelles for the delivery of platinum anticancer drugs[J]. Biomacromolecules,2015,16(2):515-523.

[11]Xiao S D,Meng X J,Shi Y,et al. Interventional study of high dose folic acid in gastric carcinogenesis in beagles[J]. Gut,2002,50(1):61-64.

[12]Sun Y,Zhang Z,Xi Z,et al. Determination of folic acid by high-performance liquid chromatography with direct electrogenerated chemiluminescence reaction[J]. Luminescence,2010,25(1):61-65.

[13]张书平,杨文革. B族维生素对防治老年血管疾病的重要性[J]. 河北医药,2007(5):478.

[14]徐玲燕. 产叶酸菌株的筛选、生物学特性研究和发酵条件优化[D]. 杭州:浙江工业大学,2012.

[15]Pavlides S,Gutierrez-Pajares J L,Iturrieta J,et al. Endothelial caveolin-1 plays a major role in the development of atherosclerosis[J]. Cell and Tissue Research,2014,356(1):147-157.

[16]Zhang S,Hunter D J,Hankinson S E,et al. A prospective study of folate intake and the risk of breast cancer[J]. Jama,1999,281(17):1632-1637.

[17]何树芬,李晓然,柳陈坚. 乳酸菌合成叶酸的研究进展[J]. 微生物学通报,2015,42(10):1994-2001.

[18]Le Blanc JG,Milani C,de Giori GS,et al. Bacteria as vitamin suppliers to their host:A gut microbiota perspective[J]. Current Opinion in Biotechnology,2013,24(2):160-168.

[19]吕加平,于景华. 乳酸菌发酵剂优良菌种的选育[J]. 中国乳品工业,2002,50(5):49-52.

[20]华鹤良.乳酸菌的分离鉴定及其抗菌肽与发酵性能研究[D]. 扬州:扬州大学,2013.

[21]Crittenden R G,Martinez N R,Playne M J. Synthesis and utilisation of folate by yoghurt starter cultures and probiotic bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology,2003,80(3):217-222.

[22]Zhu T,Koepsel R,Domach M M,et al. Metabolic engineering of folic acid production[J]. Acs Symposium,2003,225:207-219.

[23]Wegkamp A,Starrenburg M,de Vos W M,et al. Transformation of folate-consumingLactobacillusgasseriinto a folate producer[J]. Applied and Environmental Microbiology,2004,70(5):3146-3148.

[24]Sybesma W,Starrenburg M,Tijsseling L,et al. Effects of cultivation conditions on folate production by lactic acid bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology,2003,69(8):4542-4548.

[25]郭壮,王记成,闫丽雅,等. 益生菌LactobacilluscaseiZhang对酸奶风味、质地及感官特性的影响[J]. 中国乳品工业,2009(1):14-20.

[26]郭壮. 益生菌LactobacilluscaseiZhang对发酵乳质地、风味及感官特性的影响[D]. 内蒙古:内蒙古农业大学,2009.

[27]张睿,刘继超,药璐,等. 益生菌对发酵乳理化性质影响的研究[J]. 中国食品添加剂,2013(6):66-70.

[28]尚玉琳,孟祥晨. 不同酸奶发酵剂的发酵性能比较[J]. 食品科技,2011,36(10):41-45.

[29]Hassan A N,Frank J F,Schmidt K A,et al. Textural properties of yogurt made with encapsulated nonropy lactic cultures[J]. Journal of Dairy Science,1996,79(12):2098-2103.

[30]陈玮,常忠义,高红亮,等. 不同发酵剂生产的酸奶感官评定和TPA质构分析[J]. 中国酿造,2012,31(1):193-195.

[31]周兴鑫,陈臣,于海燕,等. 发酵乳的感官质量控制体系研究进展[J]. 中国乳品工业,2016(12):36-38,42.

[32]Rossi M,Amaretti A,Raimondi S. Folate production by probiotic bacteria[J]. Nutrients,2011,3(1):118-134.

[33]Hugenschmidt S,Schwenninger SM,Gnehm N. Screening of a natural biodiversity of lactic and propionic acid bacteria for folate and vitamin B12 production in supplemented whey permeate[J]. International Dairy Journal,2010,20(12):852-857.

[34]卫晓英,李全阳,赵红玲,等. 酸乳发酵剂低温刺激对凝固型酸乳质构影响机理的探讨[J]. 食品工业科技,2009,30(6):170-173.

[35]王攀. 发酵温度对羊奶酸奶粘度和持水性的影响[J]. 中国乳业,2009(11):48-50.

[36]Wang W,Bao Y,Hendricks G M,et al. Consistency,microstructure and probiotic survivability of goats’ milk yoghurt using polymerized whey protein as a co-thickening agent[J]. International Dairy Journal,2012,24(2):113-119.