夫西地酸有关物质的色谱-质谱结构鉴定

梁方梅，倪悦泠，王 璐，杭太俊，宋 敏

(中国药科大学药物分析系，南京 210009)

夫西地酸(fusidic acid,图1)，即16β-乙酰氧基-3α,11α-二羟基-4α,8α,14β-三甲基-18-去甲-5α,10β-胆甾-(17Z)-17(20),24-二烯-21-酸，是一种具有甾体骨架的抗生素，对葡萄球菌等多种革兰阳性菌有较强的抗菌作用[1-4]。夫西地酸通过抑制核糖体的易位来延长干扰因子G,阻碍细菌蛋白质的合成，此种独特的抗菌机制是夫西地酸与其他抗生素无交叉耐药性的原因[4-5]。夫西地酸的质量控制研究已有文献报道[6-11],欧洲药典(9.0版)(EP9.0)和英国药典(2017版)已收载其质量标准。但关于夫西地酸有关物质的系统研究与鉴定未见报道。

Figure1 Chemical structure of fusidic acid

本研究建立了适用于夫西地酸有关物质检查的色谱-质谱联用分析方法，通过TOF/MS测定了夫西地酸有关物质的精密相对分子质量及分子式，结合MS/MS的子离子特征，综合解析鉴定其有关物质的结构，为夫西地酸的存储条件和质量控制提供了参考依据。

1 材 料

1.1 试 剂

夫西地酸原料药(批号170910FA，江苏九阳生物制药有限公司)；夫西地酸各有关物质对照品(EP9.0杂质A、B、C、D、F、G、H、I、K、L、M，美国CATO Research Chemicals公司)。甲酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)；水(市售纯净水)。

1.2 仪 器

Agilent 1260 Infinity液相色谱-6224飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)；Thermo Dionex UltiMate 3000高效液相色谱-TSQ Quantum Ultra型LC-MS/MS联用仪(美国Thermo-Fisher公司)；BS 21S分析天平(德国Sartorius公司)。

2 方 法

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Extend-C18(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流动相A为甲醇-乙腈-水-甲酸(20∶40∶40∶0.05)，流动相为B甲醇-乙腈-水-甲酸(20∶70∶10∶0.04)，进行线性梯度洗脱(A∶B):0 min(100∶0)→28 min(0∶100)→33 min(0∶100)→33.1 min (100∶0)→38 min(100∶0)，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长为235 nm。进样量40 μL。分流比7∶3进行MS检测。

2.2 质谱条件[12]

电喷雾正离子化，TOF/MS测定喷雾电压3.5 kV，雾化氮气压力275 kPa，流量10 L/min，温度350 ℃，碎片电压200 V，参比离子m/z121.050 8(质子化嘌呤，C5H5N4+)和m/z922.009 8(质子化氟代膦嗪HP-921，C18H19O6N3P3F24+)，扫描范围m/z100～1 000。MS/MS测定的喷雾电压4 kV，雾化气压力300 kPa，辅助气压力35 kPa，毛细管温度350 ℃，二级质谱扫描碰撞氩气压力0.16 Pa，碰撞能量10～35 eV。

2.3 溶液配制

2.3.1 供试品溶液 取夫西地酸约25 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加稀释剂(甲醇-乙腈-水，10∶50∶40)溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为2.5 mg/mL的供试品溶液。精密量取上述溶液适量，加稀释剂定量稀释，配制0.1%的自身对照溶液。

2.3.2 对照品溶液 取各有关物质对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释成质量浓度均约为2.5 μg/mL的溶液作为混合杂质对照溶液。

2.3.3 强制降解试验溶液 取夫西地酸各约25 mg，分别经2 mol/L 盐酸溶液1 mL 60 ℃水浴12 h,1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL室温放置1.5 h,5%过氧化氢2 mL 60 ℃水浴3 h，稀释剂2 mL 90 ℃水浴6 h，或光照(4 500 lx)5 d，分别处理，然后加稀释剂溶解(酸碱处理溶液先中和)并稀释至10 mL，配制成质量浓度约为2.5 mg/mL的强制降解试验溶液。同时进行空白试验溶液。

3 结 果

3.1 有关物质检查

建立的夫西地酸有关物质挥发性流动相HPLC检查方法适用于质谱联用鉴定。图2为夫西地酸及其酸强制降解溶液的DAD-TIC谱图。图3为夫西地酸及其有关物质HPLC检查的典型色谱图。按保留时间由小到大顺序编号，共检出分离效果良好的19个主要有关物质。

夫西地酸供试品共检出5个有关物质，为有关物质11、13、14、17、19(图2-c～d)；采用0.1%自身对照法估算有关物质含量,仅有关物质19的含量大于 0.1%(图3-b)。强制降解试验结果表明，本品在强酸、强碱、氧化、高温和光照条件下均不稳定。酸破坏形成4个主要降解产物(图3-c，有关物质10、12、17和18)；碱破坏形成1个主要降解产物(图3-d，有关物质17)；氧化破坏形成8个主要降解产物(图3-e，有关物质1～6、8和9)；光照破坏形成5个主要降解产物(图3-f，有关物质4、6、8、9和11)；高温破坏形成4个主要降解产物(图3-g，有关物质14～17)。

Figure2 LC-MS chromatograms of fusidic acid and its typical stress solutions

a:DAD chromatograms of acid stress solutions;b:TIC chromatograms of acid stress solutions;c:DAD chromatograms of active pharmaceutical ingredient (API);d:TIC chromatograms of API

Figure3 HPLC-UV chromatograms of fusidic acid and its stress solutions

a:0.1% Reference solution;b:API;c:Acid;d:Alkaline;e:Oxidation;f:Photolysis;g:Thermal;h:Mixture of reference RSs (A-M)

3.2 有关物质的结构鉴定

采用LC-MS测得各有关物质母离子的准确相对分子质量和离子组成，以及它们的二级质谱特征碎片，并通过与夫西地酸和已知有关物质的质谱特征的对比分析，鉴定各主要有关物质的结构。结果见表1和图4。

Table1 Structures of the related substances (RSs) identified by LC-MS of fusidic acid

RS(EP 9.0 impurity)[M+H]+/ [M+NH4]+ (m/z)tR/minIon formulaDif.Product ion(m/z)Origins1(A)568.382 84.3/4.5C31H50O8NH4+2.87491,473,455,437,429Dr2584.377 04.7C31H50O9NH4+3.95507,489,471,281Dr3584.377 35.1C31H50O9NH4+3.60507,489,471,281Dr4(B)550.372 65.9C31H48O7NH4+2.31473,455,437,261,247Dr5(C)550.372 76.7C31H48O7NH4+2.07473,455,437,261,247Dr6(D)550.373 27.2C31H48O7NH4+1.17473,455,437,261,247Dr7(F)548.359 67.5C31H46O7NH4+2.74489,471,453,435,417,351-8550.374 17.7C31H48O7NH4+-0.62473,455,437,261,247Dr9550.374 38.0C31H48O7NH4+-0.93473,455,437,261,247Dr10534.376 99.1C31H48O6NH4+3.89475,457,439,421,393Dr11(G)532.361 99.9C31H46O6NH4+2.53455,437,263Dr,Pr 12457.331 610.0C29H44O4H+0.59439,421,393,351,299,281Dr13(H)532.362 110.3C31H46O6NH4+2.23455,437,263Dr,Pr14(I)475.341 911.8C29H46O5H+-0.19457,439,421,263Dr,PrAPI534.378 612.4C31H48O6NH4+0.63475,457,439,421,263API15489.356 613.8C30H48O5H+2.88457,439,421,263Dr16457.331 115.3C29H44O4H+0.22439,421,393,351,297,279,263,217,199,95Dr17(K)457.331 115.8C29H44O4H+0.26439,421,393,351,297,279,263Dr,Pr18(L)516.367 816.8C31H46O5NH4+1.16439Dr19(M)518.382 819.7C31H48O5NH4+2.39441Pr

Pr:Process related substance;Dr:Degradation product

Figure4 Chemical structures of the related substances (RS1-19) of fusidic acid

3.2.1 已知有关物质的确证 通过有关物质HPLC定位及质谱定性，确证有关物质1、4、5、6、7、11、13、14、17、18和19分别与EP9.0规定的已知有关物质A、B、C、D、F、G、H、I、K、L和M对应。对夫西地酸和各已知有关物质的一级质谱母离子准确相对分子质量、二级质谱特征碎片离子和裂解途径(图5和图6)分析，可以辅助其未知有关物质结构的推断与鉴定。

夫西地酸及已知有关物质裂解规律如下：

①夫西地酸及有关物质7、11、13、18和19的母离子(P+)中，16位的酯键易断裂为羟基，进一步与21位的羧基缩合成五元环内酯，生成相对分子质量为[P-77]+的特征碎片离子。

②有关物质14的母离子(P+)中，16位的羟基与21位的羧基缩合成五元环内酯，生成相对分子质量为[P-18]+的特征碎片离子。

③有关物质1、4、5、6的母离子(P+)中，24或25位的羟基易和21位的羧基缩合成六元环内酯，16位酯键易断裂为羟基，同时结构中的羟基脱水，生成相对分子质量为[P-77]+/[P-95]+/[P-113]+/[P-131]+的一系列特征碎片离子。

④夫西地酸及其有关物质常会甾体环断裂，产生281、279、263、265、253、217、199、189、177、175、159、145、119、95等碎片离子峰簇，尽管结构不同可能导致占主导地位的碎片离子峰不同，但碰撞电压的不同也可能会导致以上碎片离子峰簇的丰度此消彼长，因此，此类碎片离子只宜用于验证结构推断的正确性，而不能作为判定某基团存在的决定性依据。

Figure5 MS/MS spectra of fusidic acid and its impurity reference substance API (m/z534),1(m/z568),4-6(m/z548),11and13(m/z532),14(m/z475),17(m/z457),18(m/z516),19(m/z518)

Figure6 MS/MS fragmentation pathways of the product mass spectra of [M+H]+or [M+NH4]+ions of fusidic acid and its typical RSs

3.2.2 未知有关物质的确证 通过有关物质HPLC定位及质谱特征，结合夫西地酸和已知有关物质裂解规律，对各未知有关物质进行综合分析鉴定其结构。

有关物质2和3：ESI+-TOF/MS测得有关物质2和3的[M+NH4]+的准确相对分子质量分别为584.377 0和584.377 3，均与离子式C31H50O9NH4+相应，二者为同分异构体；其相对分子质量比有关物质1多16，与一个O原子相应。MS/MS主要特征碎片离子m/z489、471与有关物质1一致，均含有[P-77]+/[P-95]+碎片离子，故有关物质2和3是夫西地酸的三羟基化的同分异构产物。并且在氧化降解样品的m/z584.379 3提取离子流色谱图中显示有5个三羟基化异构体 (图7)，这与夫西地酸结构中存在两个烯键，且烯键及其α位均可发生氧化反应的特征相应。因结构中有多个手性碳，故推断有关物质2和3(图7)为夫西地酸三羟基化的非对映异构体产物。有关物质2以图7中化合物b为例进行解析，质谱裂解(图8)均得到合理归属。

Figure7 Extracted ion chromatogram ofm/z584.379 3 and inferred structures

Figure8 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+NH4]+ions of RS2

有关物质8和9：ESI+-TOF/MS测得有关物质8与9的[M+NH4]+的准确相对分子质量分别为550.374 1和550.374 3，均与离子式C31H48O7NH4+相应，与有关物质4、5、6互为同分异构体；其相对分子质量比夫西地酸多16，与一个O原子相应。MS/MS主要特征碎片离子为m/z473、455、437、261、247，其中m/z473比夫西地酸的特征碎片m/z455多16，推断有关物质8和9为夫西地酸单羟基化的同分异构产物，并且在氧化降解样品的m/z550.378 4提取离子流色谱图中显示有多个单羟基化异构体 (图9)，这与夫西地酸结构中存在两个烯键，且烯键及其α位均可发生氧化反应的特征相应。如26、27位被氧化形成一对顺反异构体[图9中化合物a(EP9.0杂质E)和化合物b]，22或23位被氧化形成两对对映异构体(图9中化合物d和e)，24位烯键可被氧化为酮(图9中化合物c)。有关物质8以图9中化合物a为例进行解析，质谱裂解(图10)均得到合理归属。

Figure9 Extracted ion chromatogram ofm/z550.378 4 and inferred structures

Figure10 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+NH4]+ions of RS8

有关物质10：ESI+-TOF/MS测得有关物质10的[M+NH4]+的准确相对分子质量为534.376 9，与离子式C31H48O6NH4+相应；相对分子质量与元素组成和夫西地酸一致，为夫西地酸异构体。MS/MS主要特征碎片离子为m/z475、457、439、421、393，丰度较高的特征碎片离子439与有关物质18相同，推测其与有关物质18有相同的母核结构。在m/z534.378 9的提取离子流色谱图中显示1个夫西地酸异构体色谱峰(图11)，即有关物质10。强制降解实验结果表明,有关物质10和18主要在酸破坏条件下产生，根据化学反应规律并参考裂解规律，推断夫西地酸在酸条件下11位羟基脱水，同时 24位烯键与水加成(根据马氏规则，羟基加在25位C)生成有关物质10。有关物质10的碎片经合理途径产生(图12)。

Figure11 Extracted ion chromatogram ofm/z534.378 9 of RS10

有关物质12和16：ESI+-TOF/MS测得有关物质12、16的[M+H]+的准确相对分子质量分别为457.331 6、457.331 1，均与离子式C29H44O4H+相应，与有关物质17互为同分异构体。比夫西地酸相对分子质量少60，元素组成少C2H4O2，与一分子H2O和乙酰基相应。有关物质12、16和17二级均需较高的碰撞能量，产生很多甾体环裂解碎片离子峰。在酸和高温破坏样品中提取离子流m/z457.331 2的色谱图中，显示共有5个异构体色谱峰(图13)，其中Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ分别为有关物质12、16和17。有关物质16的MS/MS主要特征碎片离子与已知有关物质17一致，结合二者色谱保留和极性相近特征，推断有关物质16[图13中化合物c(EP9.0杂质J)]是有关物质17的非对映异构体。有关物质12极性较大，故推断其含有游离羟基和羧基，这与其MS/MS特征碎片离子m/z439丰度较高相应，故推断有关物质12为夫西地酸3位或11位羟基脱水且16位酯键水解的降解产物(图13中化合物a和b)。有关物质12以图13中化合物b为例进行解析，质谱裂解(图14)均得到合理归属。

Figure12 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of[M+NH4]+ions of RS10

Figure13 Extracted ion chromatogram ofm/z457.331 2 and inferred structures

Figure14 MS/MS spectra of RS12,16and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+H]+ions of RS12

有关物质15：ESI+-TOF/MS测得有关物质15[M+H]+的准确相对分子质量为489.356 6，与离子式C30H48O5H+相应；比夫西地酸相对分子质量少28，元素组成少CO，与一分子C=O相应。在高温降解样品的m/z489.357 5的提取离子流色谱图中显示3个异构体色谱峰(图15)，这与夫西地酸羧基断裂，且烯键可发生氧化反应的特征相应。如夫西地酸21位脱羧酸，同时17或24位烯键被氧化为羰基的异构体产物(图15中化合物a和b)；或碳正离子发生重排,26或27位被羰基化形成一对非对映异构体(图15中化合物c)。有关物质15的主要碎片离子m/z457，与支链末端脱去一分子CH3OH相应，因此推断有关物质15为夫西地酸24位双键羰基化产物(图15中化合物b或c)。有关物质15以图15中化合物b为例进行解析，质谱裂解(图16)均得到合理解析。

Figure15 Extracted ion chromatogram ofm/z489.357 5 and inferred structures

Figure16 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+H]+ions of RS15

Figure17 Schematic representation of main RSs of fusidic acid and the stress conditions

4 讨 论

在建立的挥发性流动相色谱-质谱联用鉴定条件下，夫西地酸与各有关物质均得到有效的分离，共检测到19个有关物质；其中11个为已知有关物质(1、4、5、6、7、11、13、14、17、18和19),8个为未知有关物质。且已知杂质的洗脱顺序、夫西地酸供试品检出的杂质及强制降解产生的杂质个数与EP9.0规定的非挥发性色谱条件结果一致。

夫西地酸有关物质的相关性与降解途径见图17。强制降解实验结果表明，夫西地酸降解产物可分为3类。第1类为在酸、碱或高温条件下，导致夫西地酸结构中酯键水解形成的产物，包括有关物质14、15、16和17；第2类为在氧化或光照条件下结构中烯键及其α位发生氧化反应形成的产物，包括有关物质1、2、3、4、5、6、8、9和11。第3类为在强酸条件下结构中不同位点羟基脱水或酯键水解形成的产物，包括有关物质10、12和18。因此，夫西地酸应避光、阴凉暗处密闭存储。

本研究通过色谱-质谱联用技术对夫西地酸有关物质的分析研究，对其降解途径进行了探讨，为其存储条件和质量研究提供了参考依据。

参 考 文 献

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