Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用*

于 丹，王 莹，高 原，刘春英

(辽宁中医药大学基础医学院， 辽宁 沈阳 110032)

近年来，肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，以顺铂为代表的一线化疗药物在临床上被广泛应用，但化疗耐药和肿瘤细胞转移，使得非小细胞肺癌的5年生存率很低[1]。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胚胎发育的重要生理现象，也参与创伤愈合、器官纤维化、肿瘤转移和耐药等多种病理过程[2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即Akt)、Wnt及核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等信号通路被证明在肿瘤细胞EMT过程中发挥重要作用。Akt/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)/Snail信号通路作为多个通路的汇聚点，是否参与转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导的顺铂耐药细胞A549/DDP发生EMT尚未见报道。因此，本研究通过检测TGF-β1诱导前后Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关分子表达水平，探讨TGF-β1诱导A549/DDP细胞发生EMT的机制。

材 料 和 方 法

1 材料

A549/DDP细胞株购自中国医学科学院肿瘤细胞库。

TGF-β1购自Peprotech；抗Akt和p-Akt 抗体购于南京凯基生物技术有限公司；抗GSK-3β和p-GSK-3βSer9抗体由Abcam公司提供；抗Snail抗体购自北京博奥生物技术有限公司；抗β-actin 抗体购自Proteintech；抗上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)抗体由博士德生物公司提供。

2 方法

2.1细胞培养 A549/DDP细胞常规培养，待细胞融合度达60%，换RPMI-1640无血清培养饥饿过夜，备用。并将细胞分成3组：TGF-β1(-)组、TGF-β1(+) 组(加入5 μg/L TGF-β1作用48 h)和LY294002组(在加入5 μg/L TGF-β1的同时，每 1 mL培养液中加入5 μL LY294002[3])。

2.2细胞形态观察 细胞爬片，常规培养至融合度达60%～80%，用镊子将玻片取出。用预冷的PBS冲洗3次。4%多聚甲醛固定10 min。PBS冲洗、晾干后，将盖玻片细胞面贴于载玻片上，于倒置显微镜下观察。拍照、记录。

2.3免疫荧光法检测E-cadherin和N-cadherin的表达 A549/DDP细胞经PBS冲洗后，4%多聚甲醛室温固定20 min，0.5% Txiton X-100 处理20 min，PBS冲洗，山羊血清室温封闭30 min。I 抗[E-cadherin(1∶200稀释)和 N-cadherin(1∶200稀释)]4 ℃过夜，次日，PBS冲洗后，II 抗避光孵育2 h，DAPI常温孵育5 min，PBS冲洗，用含抗淬灭剂的封片剂封片。

2.4Western blot法检测蛋白水平 采用RIPA∶PMSF(100∶1)裂解液，冰上操作，离心提取蛋白。采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。按30 μL体积上样，电泳、转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h。I 抗孵育[GSK-3β和p-GSK-3βSer9(1∶1 000)；Akt、p-Akt、Snail、E-cadherin和N-cadherin(1∶500)；β-actin(1∶1 000)]，4 ℃过夜。次日，II 抗室温下孵育2 h后，发光、拍照，Quantity One凝胶图像分析。

3 统计学处理

SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 TGF-β1诱导前后细胞形态的变化

如图1所示，经TGF-β1作用后，细胞变得更加狭长，呈纺锤形，细胞间无成簇分布的现象，细胞间连接较为松散，失去上皮细胞形态特点。

Figure 1. The morphological changes of the A549/DDP cells treated with TGF-β1observed under microscope (×200; scale bar=5 μm).

图1各组细胞的形态学观察

2 免疫荧光检测TGF-β1对 A549/DDP 细胞E-cadherin和N-cadherin表达的影响

实验结果显示E-cadherin和N-cadherin主要定位于A549/DDP细胞的胞浆和胞膜。经5 μg/L TGF-β1作用48 h后，标记E-cadherin的绿色荧光明显减少，仅见微弱的荧光；相反，N-cadherin的表达明显增强，可见大量绿色荧光，见图2。

Figure 2. The protein expression of E-cadherin and N-cadherin in all groups (×200; scale bar=5 μm).

图2免疫荧光检测E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达

3 Western blot检测TGF-β1对 A549/DDP 细胞E-cadherin和N-cadherin表达的影响

实验结果显示，与TGF-β1(-) 组比较，TGF-β1(+) 组E-cadherin蛋白表达水平下降，N-cadherin表达明显增强(P<0.05)，见图3。

4 TGF-β1对 A549/DDP 细胞Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平的影响

实验结果显示，与TGF-β1(-) 组比较，TGF-β1(+) 组p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平明显增强，而用PI3K抑制剂LY294002作用48 h后， p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的表达水平较TGF-β1(+) 组明显下降(P<0.05)，各组间比较Akt和GSK-3β的表达水平无明显差异，见图4。

讨 论

EMT是上皮细胞向间充质细胞转化的现象，该现象由Greeburg等[4]在晶状体上皮细胞中被发现，并于1982年首次提出。发生EMT肿瘤细胞形态呈现出间质细胞形态特点，细胞失去极性，细胞间连接减弱，伸出伪足，细胞获得较高的移动能力。同时，上皮细胞标志物E-cadherin表达下调，间充质细胞标志物N-cadherin表达上调。发生EMT的细胞能够在基底膜上生长并穿透基底膜，提示EMT可能是肿瘤细胞突破基底膜的重要机制之一[5-6]。EMT与乳腺癌和结肠癌的细胞形态改变、细胞间黏附能力下降以及转移灶的形成密切相关[7-8]。Shintani等[9]研究发现，EMT可能是非小细胞肺癌对紫杉醇和顺铂耐药的重要原因。

Figure 3. The protein expression of E-cadherin and N-cadherin in all groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTGF-β (-) group.

图3Westernblot检测E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达

Figure 4. The protein levels of Akt, p-Akt, GSK-3β, p-GSK-3βSer9and Snail in all groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTGF-β1(-) group;△P<0.05vsTGF-β1(+) group.

图4Westernblot检测Akt、p-Akt和GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平

TGF-β是目前EMT研究常用的诱导剂，被认为是几乎所用上皮细胞发生EMT必不可少的诱导因子[10-11]。TGF-β通过Smad和非Smad通路(PI3K/Aat、NF-κB和Wnt等)发挥效应，诱导EMT发生[12]。大量研究PI3K/Akt 在肿瘤EMT过程中发挥举足轻重的作用，该通路的激活可使GSK-3β第9号位点的丝氨酸被泛素化降解。人Snail序列中存在2个GSK-3β保守位点，GSK-3β与Snail结合使其磷酸化，进而调节Snail在细胞内的定位及稳定性[13]。当GSK-3(Ser9)磷酸化后，可解除对Snail的抑制作用，使得细胞内Snail表达水平升高[14-15]。Snail是一类含有锌指结构的DNA结合蛋白，可以识别E-cadherin启动子上游的E-box区域，抑制E-cadherin的基因表达，促进EMT的发生[16-17]。

本研究结果显示，TGF-β1处理后，A549/DDP细胞发生间充质细胞形态转化，及EMT标志蛋白表达的变化，提示TGF-β1促进A549/DDP细胞EMT的发生。各组Akt和GSK-3β蛋白表达水平无明显差异，而TGF-β1处理后，p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的表达水平上调，同时添加PI3K抑制剂LY294002可下调p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的表达，提示TGF-β1并不影响Akt和GSK-3β的转录和表达，而是通过影响磷酸化水平改变其活性，进而提高Snail的表达水平，促使EMT发生。

综上所述，TGF-β1可能通过Akt/GSK-3β/Snail信号通路诱导A549/DDP细胞EMT发生，进而影响细胞扩散及侵袭能力，该通路可能是导致非小细胞肺癌转移及对顺铂耐药的重要环节。

[参 考 文 献]

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