HIPK2基因对缺氧复氧诱导的NRK-52E肾小管上皮细胞活力和凋亡及JAK2/STAT3信号通路的影响*

朱彬蔚，卞蓉蓉，陈冬平，梅长林

(第二军医大学长征医院肾内科， 上海 200001)

急性肾损伤是临床上常见的一种综合征，缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是引起该病的一个重要因素[1]。近些年来，在临床上常采用导管术、溶栓疗法和肾脏移植等新技术重新恢复缺血肾组织血流，但却引起肾脏IRI的发生[2]。肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells，RTEC)对脓毒血症、中毒和缺血缺氧等损伤因素较敏感，缺氧损伤是引起各种肾脏疾病发生的重要原因，主要的病变是小管上皮细胞的凋亡和坏死，而小管上皮细胞的增殖、去分化及再分化是损伤后修复的基础[3]。目前已发现在肾脏缺氧损伤后有多种热点分子，如血管内皮生长因子、结缔组织生长因子和细胞间黏附因子等参与了修复过程，但却不是有效的治疗手段[4]。因此，寻找有效的急性肾损伤治疗靶点具有重要意义。同源结构域相互作用蛋白激酶2(homeo-domain-interacting protein kinase 2，HIPK2)是HIPK家族中的一员，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，参与调控基因表达，受到信号诱导后激活，在细胞增殖和凋亡等信号转导过程中有重要作用[5]。近些年的研究表明，HIPK2是一个肿瘤抑制基因，可影响肝癌和结直肠癌等多种肿瘤的生物学特性[6-7]；近期研究报道，HIPK2是肾脏纤维化过程中的一个关键调节因子，其高度活跃时可引起肾脏纤维化的发生[8]。而HIPK2在急性肾损伤中的作用还未清楚。因此，本研究通过将靶向HIPK2的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染大鼠肾近曲小管上皮细胞株NRK-52E，并进行缺氧复氧(hypoxia and reoxyge-nation，H/R)处理，检测细胞增殖和凋亡情况，并研究其作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

大鼠肾近曲小管上皮细胞株NRK-52E购自ATCC；胎牛血清和胰蛋白酶均购自Gibco； DMEM培养基购自HyClone； LipofectamineTM2000转染试剂盒购自Invitrogen； CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物技术公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购自Nerck Millipore；Fluo-3/AM购自Biotium；兔抗人cleaved Caspase-3和caspase-12多抗、鼠抗人Bcl-2单抗、鼠抗人Bax单抗、兔抗人磷酸化Janus激酶2(phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2)单抗和兔抗人磷酸化信号转导及转录激活因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)单抗均购自Abcam；酶标仪购自Bio-Rad；流式细胞仪购自BD。

2 实验方法

2.1细胞培养及分组 取出冻存在液氮罐中的NRK-52E细胞，37 ℃水浴快速溶解，溶解后细胞置于37 ℃、5% CO2及95% O2的培养箱中用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，换液去除未贴壁细胞，细胞生长融合至80%以上，用胰蛋白消化后进行传代。细胞达80%融合后换成不含胎牛血清的高糖培养液同步化培养24 h，随机分为正常对照组(control组)、阴性对照组(HIPK2-NC组)、H/R组和HIPK2-siRNA+H/R组。

2.2HIPK2-siRNA转染NRK-52E细胞效率的检测 HIPK2-siRNA转染NRK-52E细胞参照LipofectamineTM2000说明书。取转染48 h的细胞，加入细胞裂解液提取细胞中蛋白，BCA试剂盒定量蛋白，制备5%的浓缩胶和12%的分离胶，取40 μg蛋白样品与上样缓冲液充分混匀，100 ℃煮沸变性5 min，行SDS-PAGE分离(浓缩胶电压为80～100V，电泳约30 min;分离胶电压120 V，电泳约1.5 h)，电泳结束后转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭， I 抗孵育(HIPK2和内参照GAPDH皆按照1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入HRP标记的羊抗兔抗体 II 抗(1∶2 000稀释)，洗膜，加入配置好的化学发光试剂，室温孵育2 min，曝光、显影、定影。Quantity One软件对蛋白灰度值进行分析。

2.3缺氧复氧细胞模型的制备 取转染48 h后的细胞，缺氧制备前将培养液换成磷酸盐缓冲液溶液，置于含有体积分数为1% O2、4% CO2及95% N2混合气体缺氧的37 ℃培养箱中培养，1 h后，换为正常培养基培养，置于5% CO2及95% O2的培养箱内2 h，收集细胞。

2.4CCK-8法检测细胞活力 各组细胞活力采用CCK-8法检测。每孔加入CCK-8液10 μL，37 ℃孵育4 h，酶标仪以波长490 nm测定各孔的吸光度(A)值。实验重复3次。以吸光度值反映细胞活力。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡情况。将5×105个NRK-52E细胞接种于6孔板中，按照前面分组处理后，胰蛋白酶消化收集细胞，离心，弃掉上清，预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，离心，弃上清，加入结合缓冲液500 μL重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，充分混匀后，置于4 ℃避光环境中孵育15 min，再加入PI 5 μL，置于室温避光环境中5～15 min，1 h内上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验重复3次。

2.6Ca2+荧光强度检测 采用流式细胞仪检测游离的Ca2+荧光强度。胰蛋白酶消化后收集细胞，离心，磷酸盐缓冲液洗涤2遍，细胞中加入1 μmol/L的钙敏感荧光探针Fluo-3/AM，充分振荡混合均匀，置于37 ℃避光条件下孵育45 min，磷酸盐缓冲液洗涤除去没有结合的燃料，继续15 min孵育后送检(1 000个细胞)。Fluo-3/AM的发射波长及激发波长分别为526 nm和488 nm。细胞内游离Ca2+浓度通过荧光强度反映。实验重复3次。

2.7Western blotting检测蛋白水平 细胞内增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、 caspase-12、Bcl-2、Bax及JAK2/STAT3信号通路p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的检测参照方法2.2进行。

3 统计学处理

所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HIPK2-siRNA转染NRK-52E细胞效果

HIPK2-siRNA组HIPK2的蛋白表达显著低于control组(P<0.05)，而在HIPK2-NC组HIPK2的蛋白表达与control组差异无统计学显著性，见图1。这说明转染HIPK2-siRNA可显著降低HIPK2的表达。

2 HIPK2-siRNA转染可促进H/R诱导的NRK-52E细胞活力

H/R组的细胞活力显著低于control组(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R组细胞活力显著高于H/R组(P<0.05)，见图2。

3 HIPK2-siRNA转染可抑制H/R诱导的NRK-52E细胞凋亡

H/R组细胞凋亡率显著高于control组(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R组细胞凋亡率显著低于H/R组(P<0.05)，见图3。

4 HIPK2-siRNA转染可降低H/R诱导的NRK-52E细胞的Ca2+荧光强度

H/R组Ca2+荧光强度值显著高于control组(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R组Ca2+荧光强度值显著低于H/R组(P<0.05)，见图4。

Figure 1. The protein expression of HIPK2 after HIPK2-siRNA was transfected into NRK-52E cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图1HIPK2-siRNA转染NRK-52E细胞后HIPK2的蛋白表达

Figure 2. The effect of HIPK2-siRNA transfection on the viability of NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

图2HIPK2-siRNA转染对H/R诱导的NRK-52E细胞活力的影响

5 HIPK2-siRNA转染对H/R诱导的NRK-52E细胞增殖及凋亡相关蛋白表达的影响

H/R组的Ki67和Bcl-2蛋白表达显著低于control组(P<0.05)，cleaved caspase-3、 caspase-12和Bax的蛋白表达显著高于control组(P<0.05)；而HIPK2-siRNA+H/R组Ki67和Bcl-2蛋白表达显著高于H/R组(P<0.05)，cleaved caspase-3、caspase-12和Bax的蛋白表达显著低于H/R组(P<0.05),见图5。

6 HIPK2-siRNA转染可下调H/R诱导的NRK-52E细胞JAK2/STAT3信号通路蛋白的磷酸化水平

H/R组的p-JAK2和p-STAT3蛋白表达均显著高于control组(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R组的p-JAK2和p-STAT3蛋白水平显著低于H/R组(P<0.05),见图6。

Figure 3. The effect of HIPK2-siRNA transfection on the apoptosis of NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

图3HIPK2-siRNA转染对H/R诱导的NRK-52E细胞凋亡的影响

Figure 4. The effect of HIPK2-siRNA transfection on Ca2+fluorescence intensity of NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

图4HIPK2-siRNA转染对H/R诱导的NRK-52E细胞Ca2+荧光强度的影响

讨 论

肾IRI是引起缺血性肾衰竭的一个主要原因，如何有效防治肾IRI是国内外学者关注的热点[9]。肾IRI的发生机制较为复杂，RTEC凋亡是其发生的一个重要机制，主要与钙超载、氧自由基增多和能量代谢障碍等因素有密切联系[10]，因此研究有效的肾脏损伤治疗方法尤为重要。HIPKs家族分为HIPK1、HIPK2和HIPK3。小鼠HIPK2基因定位于6B染色体上，人类HIPK2基因定位于7q32～34，是一种细胞核内的丝苏氨酸蛋白激酶。近些年的研究发现，HIPK2是一个有多种功能潜在的肿瘤抑制因子，可通过调控肿瘤细胞中一些关键分子通路，而抑制肿瘤生长及使药物敏感性增强[11-12]。随着对HIPK2研究的深入，其在肾脏中的作用受到广泛关注。研究发现，HIPK2可通过调节Notch、p53和Smad3等通路在肾脏中发挥促炎和纤维化作用[13-14]。最新研究发现，HIPK2表达的抑制可减缓肾脏纤维化的进程，可作为肾脏纤维化治疗的靶点[15]。但关于HIPK2在肾损伤中的研究不多。

Figure 5. The effect of HIPK2-siRNA transfection on the expression of proliferation-and apoptosis-related proteins in the NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

图5HIPK2-siRNA转染对H/R诱导的NRK-52E细胞增殖及凋亡蛋白表达的影响

本研究将靶向HIPK2的siRNA转染NRK-52E细胞，细胞中HIPK2的表达明显降低，说明转染后可明显抑制HIPK2表达。细胞经过H/R处理，通过CCK-8法及流式细胞术分别检测细胞活力及凋亡情况，发现H/R处理细胞活力明显降低，凋亡率增加，而HIPK2-siRNA+H/R处理可改善这一现象。这提示沉默HIPK2对急性肾损伤的肾小管起到保护作用。Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原，是检测细胞增殖活性比较准确、理想、可靠的抗原，已在多种疾病的研究和探讨中得到广泛的应用[16-18]。细胞凋亡信号有线粒体和死亡受体途径2条经典的传导通路。近些年的研究发现，过度的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可引起细胞凋亡启动，是一条新的引起细胞凋亡的信号传导通路，可特异性使caspase-12激活，而caspase-12可裂解caspase-3等一些下游效应蛋白酶，最终引起细胞凋亡[19-20]。研究发现，H/R刺激肾上皮细胞可触发ERS，引起caspase-12的激活[21]。Ca2+可参与多种细胞功能的调节，是细胞内正常生理功能维持的重要物质基础，研究发现，I/R损伤可增加细胞内Ca2+，活化caspase-12，从而诱导细胞凋亡[22]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的2个重要蛋白，Bcl-2/Bax的比例是引起细胞凋亡启动的关键因素，Bcl-2/Bax比率上调可使细胞凋亡抑制，Bcl-2/Bax比率下调可导致细胞凋亡增多[23]。研究发现，在肾脏疾病中Bcl-2和Bax发挥至关重要的作用[24]。本实验结果显示，沉默HIPK2促进H/R处理的NRK-52E细胞增殖的机制是上调Ki67，抑制凋亡的机制是上调Bcl-2表达，下调caspase-12、cleaved caspase-3和Bax表达。

Figure 6. The effect of HIPK2-siRNA transfection on JAK2/STAT3 signaling in NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

图6HIPK2-siRNA转染对H/R诱导的NRK-52E细胞JAK2/STAT3信号的影响

JAK2/STAT3信号通路参与细胞的增殖、凋亡、分化、免疫调节和迁移等生理过程，正常RTEC有低水平活化，主要介导修复和增生[25-26]。近些年在肾脏疾病中的调控作用受到广泛关注，已被证实其与足细胞、肾小管上皮细胞、系膜细胞等有密切关系[27]。JAK2/STAT3信号通路的激活可引起RTEC凋亡，可能参与乙肝病毒对肾组织直接损伤的致病机制[28]；抑制JAK2/STAT3信号可降低RTEC的转分化[29]；H/R条件可激活JAK2/STAT3，而抑制其活性后对RTEC起保护作用[30]。本研究结果显示，HIPK2表达的抑制可下调NRK-52E细胞JAK2/STAT3信号表达，这与前人在肾脏中的作用研究是一致的。

综上所述，抑制HIPK2基因可促进缺氧复氧诱导的NRK-52E肾小管上皮细胞生长，下调JAK2/STAT3信号通路，降低凋亡率，上调Ki67，从而上调Bcl-2表达，同时下调caspase-12、caspase-3和Bax表达。HIPK2基因可能是急性肾损伤治疗的一个新的靶点。但本研究还未进行体内实验研究，存在一定的局限性，这也是我们后期实验研究的重点。

[参 考 文 献]

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