CD133联合外周循环肿瘤细胞在结直肠癌预后评估中的应用研究

杨国华 郑圣斌 林彩锋 黄若磊

结直肠癌发病率为恶性肿瘤第三位，病死率位居恶性肿瘤第四位，常见死亡原因为肿瘤复发或转移。近年来，国内外学者研究发现结直肠癌组织中存在一群细胞表面表达CD133的亚组癌细胞，含有该组癌细胞的肿瘤组织其复发率及转移率明显升高。外周循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)指外周循环血液中的肿瘤细胞，学者研究[1-2]发现CTC数量与病人预后呈负相关，数量越多其预后越差。结直肠癌预后判断一直是结直肠癌临床研究热点，本文拟对CD133联合CTC两因素在结直肠癌预后评估应用的可行性作一研究。

资料与方法

一、一般资料

收集自2012年1月至2013年1月福建省立医院胃肠外科及肿瘤外科132例结直肠癌手术标本，年龄为(52.7±13.9)岁，年龄范围为35～86岁。132例均行术前肠镜及术后标本病理证实，其中高分化29例，中分化72例，低分化31例；按美国国立综合癌症网络(NCCN)指南2016年第2版TNM分期Ⅰ期26例，Ⅱ期32例，Ⅲ期51例，Ⅳ期23例。

二、随访方法及内容

采取病人门诊随访及电话随访，术后前2年每3个月复查，第3年每半年复查，复查内容：血常规、生化、癌胚抗原(CEA)、CTC，胸片、腹部B超；每半年复查全腹及胸部CT，每年复查肠镜。

三、标本组织中CD133测定

10%甲醛溶液固定新鲜组织标本，连续薄切厚4 μm病理切片共3张，常规病理HE染色，采用ABC法行免疫组织化学病理染色。步骤如下：切片常规脱蜡后用梯度乙醇水化，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后加入一抗鼠抗人CD133单克隆(1∶40)，用二氨基联苯胺(DAB)显色后加入苏木精复染，树脂封片。参考文献[3]标准：CD133阳性表达为境界清晰、突出于背景的棕黄色，定位于细胞质、细胞膜同时呈棕黄色亦为阳性。计分标准参照Hilbe等[4]的方法，随机选取4个高倍视野约200个细胞，计数肿瘤细胞CD133阳性数，取三张阳性切片平均值作为计数结果，细胞数>10%为阳性，≤10%为阴性。

四、CTC测定

术前采外周血10 ml，置于50 ml离心管中1 500 r/min离心，后加入CS1血小板裂解液45 ml后再次离心，去除血清等上清至12 ml，摇匀加入CS2红细胞裂解液裂解红细胞，离心去除上清，留下白细胞与特种细胞沉淀，加300 μl CS1摇匀沉淀细胞，加入磁微粒吸附离心，去除结合白细胞的磁微粒沉淀。再次离心去上清至100 μl，加CF1混匀细胞悬液涂片，置25℃～33℃无风烘箱烘干。染色鉴定：将细胞干片加CF2固定液固定8 min后，浸泡SSC试剂10 min后，加入杂交探针，放入杂交仪杂交1.5 h后，取出浸泡43℃预热后的甲酰胺试剂15 min，再次浸泡SSC试剂10 min，用BSA清洗标本区后加入CD45孵育1 h后取出加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPA)染色，盖上盖玻片，放置4℃冰箱保存。最后使用荧光显微镜先在蓝色通道下找到靶细胞层面，换到20倍物镜，分别在三种通道(蓝色、红色、橙色或绿色)下观看信号、细胞状态、CD45着色等情况。CTC细胞表现为：单个细胞状态，核质均匀，未发现分层，细胞表面无或仅一颗结合白细胞磁微粒；红色通道下未见CD45红色，CD45阴性。橙色或绿色信号3个或3个以上，且在细胞核上。我们参考文献[5]标准：CTC>3个/7.5 ml为高水平量(H-CTC)，≤3个/7.5 ml为低水平量(L-CTC)。

五、观察指标

观察CD133、CTC与临床病理各因素之间的关系，并进一步将实验分为4个组，第1组为CD133阴性(CD133-)L-CTC，第2组为CD133-H-CTC，第3组为CD133阳性(CD133+)L-CTC，第4组为CD133+H-CTC，绘制各组的3年生存曲线。

六、统计学分析

结 果

一、随访情况

本组完整随访了124例，失访8例；随访病例中CD133-L-CTC共59例，CD133-H-CTC共21例，CD133+L-CTC共35例，CD133+H-CTC共9例。

二、临床各因素与CD133、CTC之间的关系

CD133阳性组与CD133阴性组病人在淋巴结转移、远处转移、腹膜种植、组织分化、神经脉管侵犯等因素方面比较，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；而在结肠癌位置(P=0.755)、病人性别(P=0.069)、年龄(P=0.697)、肿瘤浸润深度(P=0.231)、CEA水平(P=0.054)方面两组差异均无统计学意义。CTC高水平量组与CTC低水平量组病人在肿瘤位置、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、腹膜种植、组织分化、神经脉管侵犯等因素方面比较，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(表1)

三、各组生存曲线关系

CD133-L-CTC组生存时间与CD133+L-CTC组之间差异无统计学意义(P=0.452)；但明显高于CD133-H-CTC 组(P=0.037)及CD133+H-CTC

表1 临床各因素与CD133、CTC之间的关系(例)

组(P<0.01)；CD133+L-CTC组生存时间明显高于CD133-H-CTC组(P=0.042)及CD133+H-CTC组(P<0.01)；CD133-H-CTC组生存时间明显高于CD133+H-CTC组，两组之间差异具有统计学意义(P=0.035)。(表2、图1)

表2 各组生存时间及95%可信区间(d)

注：与CD133-L-CTC组比较，aP<0.05；与CD133-H-CTC组比较，bP<0.05；与CD133+L-CTC组比较，cP<0.05

四、CTC镜下特征

CTC在镜下表现：细胞呈单个细胞状态，核质均匀，红色通道下未见CD45红色，CD45阴性。橙色或绿色信号3个或3个以上，且在细胞核上。(图2、3)

图1 4组3年生存曲线图

图2 CTC在荧光显微镜(×40)镜下表现 A．CTC单个细胞状态，细胞核上呈3个橙色及1个绿色信号，核质均匀，CD45阴性，未见红色；B．CTC单个细胞状态，细胞核上呈3个橙色及2个绿色信号，核质均匀，CD45阴性，未见红色

图3 CD133免疫组织化学染色切片(×20) CD133阳性表达为境界清晰、突出于背景的棕黄色(箭头所示)，定位于细胞质、细胞膜

讨 论

结直肠癌是全球肿瘤死亡的主要原因之一，其致死的主要原因为肿瘤复发或转移，大约有15%～25%的病人就诊时同时合并肝转移，25%～50%在原发灶切除术后发生肝转移[6-7]。本研究发现：结直肠癌组织中CD133阳性与肿瘤淋巴结转移、远处转移、腹膜种植、组织分化、神经脉管侵犯明显相关。这可能与CD133表达上调在结直肠癌中增高肝转移率，其预后更差;学者研究表明对于结直肠癌CD133阳性干细胞样细胞，它们与结直肠肿瘤的侵袭和分化呈正相关[8-11]。本研究还发现，CD133阳性与阴性病人在术后3年内二者生存曲线无明显差异，但术后2年时CD133阳性病人其生存时间开始低于CD133阴性组，远期生存时间有待进一步随访。

近年来国内外学者从结直肠癌肝转移病人外周血发现CTC，血液中CTC的分子表征提供了替代或补充的非侵入性方法组织活检[12-13]；CTC可作为结直肠癌伴肝转移病人的独立预后因素，CTC阳性组的总生存期及无病生存期明显低于阴性组[14]。本研究结果表明：CTC数量与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、腹膜种植、组织分化、神经脉管侵犯呈明显正相关，而上述几个因素是结直肠癌术后预后不良主要因素[15]；本研究结果表明：CTC低水平量组其3年生存期明显好于高水平量组，CD133-L-CTC组生存时间为(1 002.8±39.1) d，CD133+L-CTC-组为(980.5±38.8) d，明显高于CD133-H-CTC组的(782.5±75.8) d及CD133+H-CTC组的(368.6±31.0) d，差异均具有统计学意义，说明CTC高水平的结直肠癌预后差，其原因与上述结直肠癌预后不良因素相关。本研究还发现，CTC还与肿瘤位置有关，左半结肠CTC水平明显高于右半结肠，两组比较差异具有统计学意义。这与临床左半结肠癌预后明显差于右半结肠相符，其具体分子机制目前尚不明，有待进一步分子机制研究。

通过本研究表明，CD133联合CTC可用于结直肠癌术后3年生存时间评估，CD133阴性且CTC低水平量组预后好，而CD133阳性且CTC高水平量组预后差。CD133可能与病人3年生存期无明显相关，可能与远期生存时间有关；而CTC水平与病人近期生存时间明显相关。其远期预后评估有待一步随访。

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