外周血结核感染T细胞斑点试验和胸水腺苷脱氨酶活性检测在结核性胸腔积液诊断中的应用评价*

韩利梅，李 新，穆清爽，努尔阿米娜·铁力瓦尔迪，张 慧，古力鲜·马合木提

新疆医科大学第二附属医院呼吸科 (乌鲁木齐 830063)

结核病是全球性质的重大传染性疾病之一 。世界卫生组织2004年的报告显示，结核病的确诊率仅约37%，即使在发达国家也仅有50%[1]。尤其是对于结核性胸膜炎(Tuberculous pleurisy,TBP)等肺外结核，诊断与鉴别诊断比较困难，极易造成误诊、漏诊和延迟诊断，TBP诊断主要依靠检验与检查手段，然而胸部检查敏感性较差。虽然经皮胸膜活检具有较高的敏感度，但其盲目性较大，加之取材有限，极易诱发气胸等并发症。外科胸腔镜花费大、无菌操作要求高，且视野有限，极易发生漏诊[2，3]。因此迫切需要寻找一种快速、准确、可靠的诊断方法。在胸腔积液的生化检测中，ADA活性检测被认为是诊断结核性胸膜炎较为准确的指标[4]。目前，外周血T-SPOT.TB开始作为新的诊断结核感染方法广泛应用,该种检测方法具有较高敏感度和特异度[5]。本研究旨在胸腔积液患者进行以上两种方法检测，进一步明确其对于结核性胸腔积液的诊断价值。

资料与方法

1 一般资料 选取2015年1月至2016年11月在我院住院的122例胸腔积液患者，将纳入患者根据症状、结核分歧杆菌培养、痰涂片抗酸染色、病理学检验以及临床抗结核反应，将所有纳入患者分为结核组(n=52例)和非结核组(n=72例)，两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2.1 胸腔积液ADA检测：胸腔穿刺采集胸腔积液，中量和少量积液者在B超定位下进行穿刺取积液，取5 ml胸腔积液于无菌试管中，离心10 min后取上清液进行ADA水平测定。试剂盒由美国贝克曼公司生产，并采用同一公司的生化分析仪进行结果分析， ADA>45 U/L作为诊断临界值。

2.2 T-SPOT.TB检测：采集患者外周血5 ml置于肝素抗凝管中，分离单个核细胞，经过两次洗涤与重悬后加入相应的培养液制成细胞稀释液，留待备用。试剂盒来自英国OXFD公司，试验步骤按照试剂盒说明书进行。

根据A孔和B孔来判断反应结果：①阴性对照孔如果出现的斑点数为0～5，那么阳性结果设定：要求A孔或B孔出现的斑点数减去阴性对照孔出现的斑点数的数值应≥6；②如果阴性对照孔发现的斑点数≥6，那么阳性结果设定：要求出现在A孔或B孔的斑点数要超过或等于阴性对照孔出现斑点数的2倍。

2.3 其他检测：所有纳入患者行痰分歧杆菌培养、痰涂片抗酸染色、组织病理学检查。

结 果

1 外周血T-SPOT.TB与ADA检测结果比较 结核组的外周血T-SPOT.TB与ADA阳性率均明显高于非结核组(P<0.01)，结核组外周血斑点平均数与ADA活性也高于非结核组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1，表2。

2 ROC曲线分析 ROC曲线可以用来分析各项检测指标对于结核性胸腔积液的诊断效果，由图1及表3分析得出，A、B孔斑点平均数ROC曲线下的面积(AUC)>0.9，ADA的AUC为0.846，可见A、B孔斑点平均数的诊断价值较高。A、B孔斑点平均数的敏感性为98.00%，特异性73.60%，ADA的敏感性91.80%，特异性82.60%。

表1 两组患者T-SPOT.TB与ADA阳性率比较[例(%)]

表2 两组患者外周血斑点平均数与ADA活性比较

图1 外周血A、B孔斑点平均数及ADA的ROC曲线

检测指标AUC95%C.I.P截点敏感性(%)特异性(%)A孔斑点平均数0.9210.859^0.971<0.01098.0073.60B孔斑点平均数0.9190.862^0.967<0.01098.0073.60ADA(U/L)0.8460.781^0.918<0.012891.8082.60

3 外周血T-SPOT.TB与ADA互补关系 结核组中4例患者外周血T-SPOT.TB阴性，但有3例ADA检测结果为阳性。非结核组中有12例外周血T-SPOT.TB为阳性，但有10例ADA检测为阴性。

讨 论

TBP属于最常见的肺外结核病，主要与结核分枝杆菌及其他代谢产物浸及高敏状态的胸膜腔所致[4]。TBP主要表现为胸腔积液所致的局部症状(胸痛、呼吸困难、干咳等)与全身中毒症状(出汗、畏寒、发热、盗汗、食欲不振等)，积液少时仅有气促、胸闷等症状，大量积液形成后可压迫肺、纵隔与心，加重呼吸困难，且随着积液形成与聚集的增加，呼吸困难症状越为明显，甚至可导致端坐呼吸与发绀[5]。目前，临床主要采用胸膜活组织检查、结核菌素皮肤试验、胸腔积液细菌学检查(结核分枝肝菌培养与抗酸染色涂片)与胸腔积液生物化学检查等。其中胸膜活组织检查具有较多方式，但其各有缺陷；结核菌素皮肤试验所使用的结核菌素纯蛋白衍生物为200多类蛋白的混合物，含有卡介苗与非结核分枝杆菌的共同抗原成分，所以接种卡介苗的群体经该技术检查后可呈现较高的假阳性率[6]；胸腔积液细菌学检查则是诊断结核性胸膜炎的金标准，然而耗时长，阳性率过低[7]。胸腔积液生物学技术是诊断结核性胸膜炎主要方法，尤其是胸水ADA活性检查现已成为许多国家诊断结核性胸膜炎的常规技术。有研究对ADA在结核性胸膜炎中的应用效果进行了荟萃分析，认为对胸腔积液进行ADA检验具有显著的应用价值[8]。也有学者认为，ADA特异性与敏感度偏低，其中特异度偏低多见于类风湿性疾病与肺炎旁积液患者，而敏感性降低可能与机体免疫功能减退及早期炎症有关[9]。

近年来，随着临床检验技术的不断发展与完善，在特异T细胞检测中，ELISPOT已成为最敏感的方法之一，该技术能够将抗原特异细胞从数量众多的外周血单个核细胞中检测出来。Lalvani根据ELISPOT检测的相关原理，利用ESAT-6和CFP-10，从外周血结核中检测出了特异性的T细胞[10]，因此T-SPOT.TB开始作为诊断结核感染的新方法而应用到临床。部分研究发现，T-SPOT.TB具有较佳的特异性与敏感性，且不受卡介菌的影响。有学者研究认为，T-SPOT.TB对于结核病具有显著的诊断价值，尤其是对于结核性胸膜炎，阳性率可高达91.67%[11]。此外，T-SPOT.TB的高敏感性已被多项临床试验证实。王永生等[12]对结核性胸膜炎的患者进行了外周血T-SPOT.TB检测，发现其敏感性达到了95.8%。学者郭晓酮等[13]对比了胸腔积液ADA与外周血T-SPOT.TB对TBP的 诊断效果，结果显示胸腔积液ADA与外周血T-SPOT.TB诊断TBP均具有较佳的特异度(94.4%VS86.1%)，但T-SPOT.TB较ADA的敏感度更高(88.9%VS46%)，且两者联合检测的敏感度高达92.1%，认为临床工作中将T-SPOT.TB与ADA联合应用可以有效提高TBP的诊断率。本研究发现结核组的外周血T-SPOT.TB与ADA阳性率均明显高于非结核组，结核组外周血斑点平均数与ADA活性也显著高于非结核组。A、B孔斑点平均数ROC曲线下的面积(AUC)>0.9，敏感性达到了98.00%，与既往多项研究基本一致[14]。T-spot.TB是检测早期分泌抗原(ESAT-6)和培养过滤蛋白(CFP-10)这2个抗原刺激时淋巴细胞分泌的INF-γ，计数荧光标记释放TNF-γ的T淋巴细胞的个数来了解机体是否处于结核感染状态。与刘菲等[15]发现ESAT-6与CFP-10的融合蛋白敏感性要比ESAT-6单用时明显增高，本研究中单用ESAT-6或单用CFP-10均具有较高敏感性(98.00%)，考虑与样本量大小、研究对象差异及有可能的误差相关，需要进一步的大样本详尽数据支持。同时，相较于结核菌素试验，T-SPOT.TB不受卡介苗的影响，且多数非结核分枝杆菌具有较低的交叉免疫反应，检测周期短，操作简便，还适用于支气管肺泡灌洗液、腹腔积液、痰液、脑脊液等标本，应用范围较广。

研究中显示，A、B孔斑点平均数的特异性为73.60%，ADA的特异性82.60%，两者的诊断特异性均不是特别理想，笔者对两者的互补关系也进行了研究，结果显示结核组中4例患者的外周血T-SPOT.TB阴性，但有3例的ADA检测结果为阳性。非结核组中有12例外周血T-SPOT.TB为阳性，但有10例ADA检测为阴性。可以看出，两者的联合检测对诊断结核有更高的价值。非结核组中T-SPOT.TB假阳性率较高，笔者考虑可能与陈旧性结核及潜伏期结核相关，当然另一可能原因与目前的检测手段无法对肺外微小结核灶进行有效的发现有关[8]。

综上所述，外周血结核感染T细胞斑点试验是一种快速 、简单、准确、无创的检测手段，对于诊断结核性胸腔积液价值较高，但特异性偏低，与ADA联用时诊断会更为准确。

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