三种核酸提取试剂盒效果比较试验

，，， ，

(1.湖南农业大学 动物医学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省双峰县永丰镇动物防疫站,湖南 娄底 417700；3.湖南省双峰县畜牧局,湖南 娄底 410000)

目前,PCR检测技术被广泛运用于猪病检测和诊断过程。病毒核酸的提取效果显得至关重要。核酸提取的方法很多，如Trizol法、 RNA提取试剂盒等。Trizol法，既可以用来分离完整核酸，也可以进行大批量的核酸的提取，但是Trizol法操作繁琐，对实验员的要求较高。相比Trizol法，试剂盒提取步骤简便。市场上销售的试剂盒的种类很多，但产品的质量参差不齐，这在一定程度上妨碍了实验员对特定病原体的检测。为了解不同公司核酸提取试剂盒的效果,我们选择三种国产试剂盒，以PRRSV活疫苗为样本，根据提取的PRRSV核酸浓度和QRT-PCR检测结果，对这三种核酸试剂盒提取效果进行评估。

1 材料与方法

1.1 试验疫苗

猪繁殖与呼吸障碍综合征活疫苗10头份(湖南中岸生物药业有限公司提供)。

1.2 主要仪器和试剂盒

荧光定量PCR仪(BIO-Rad公司，型号CFX ConnectTMOptics Module )，超微量核酸分光光度计(Thermo SCIENTFIC公司提供，型号Nanodrop2000 ND-2000)，RNA提取试剂盒，三种RNA提取试剂盒共4个批次，分别编号为A、B、C1和C2(A试剂盒批次：17052601；B试剂盒批次：20170727204；C1试剂盒批次：012080hgz；C2试剂盒批次：217085hgz)，猪繁殖呼吸综合症病毒北美型经典株与高致病性变异株实时荧光RT-PCR检测试剂盒(湖南国测生物科技有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 疫苗分组 取2400 μL 稀释好的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，分为12份样品，200μL/份。将12份样品分为4组(A、B、C1和C2)，每组3个。

1.3.2 核酸提取 按照A、B、C三种核酸提取试剂盒的说明书进行提取。

1.3.3 RNA浓度测定 按 Nanodrop2000 ND-2000核酸分光光度计说明书进行，鉴定步骤如下：先用超纯水洗涤点样口2次，再用无尘纸擦拭干净。滴加样品稀释溶液1-2μL,盖上样品臂，点击BLANK measure键呈绿色，调零完毕。用无尘纸擦拭干净，再滴加样品检测。测量完成后，清洗仪器，关闭仪器。

1.3.4 RNA纯度测定 Nanodrop2000 ND-2000核酸分光光度计检测，OD260/OD280显示结果表示核酸的纯度，纯RNA的OD260/OD280值=2.0，纯DNA的OD260/OD280值=1.8。

1.3.5 实时荧光定量RT-PCR 将每种试剂盒提取的三份PRRSV 核酸样品合并为一份，12份核酸样品合并成4份，按照PRRSV QRT-PCR检测试剂盒说明书进行QRT-PCR扩增。反应体系：反应液43μL，酶混合液2 μL，PRRSV内置参照0.5μL，充分混匀成PCR-Mix，离心备用。反应条件：逆转录50℃ 30 min，预变性 95℃ 2min，扩增95℃15 s，60℃ 45 s，40个循环。

1.3.6 数据分析 利用SPSS18.0的系统软件进行数据处理，对数据进行单因素均值、标准差计算分析，两组样本间均数比较，用独立样本t检验，检验水准：α ﹤0.05

2 结果

2.1 检测12份样品RNA浓度

A、B、C1、C2三种试剂盒，所提取的12份样品RNA浓度和OD260/OD280值见表1。从表1中可以看出，B试剂盒RNA的浓度最高，为4.4 ng/μL。A、C1、C2试剂盒提取的RNA浓度分别为1.7 ng/μL、3.27 ng/μL、4.13 ng/μL。B试剂盒提取的RNA浓度明显大于A、C2(P<0.05)。同时，B试剂盒提取的RNA浓度与D试剂盒提取的RNA浓度相比无明显差异(P=0.8)。

表1 三种试剂盒提取RNA的浓度和吸光度比值

2.2 荧光定量RT-PCR检测结果

荧光定量RT-PCR检测结果(图1)显示：合并后的4份样品检测结果(Ct值)为： 23.49(A)、21.71(B)、24.97(C1)和25.29(C2)。由于Ct值越小表示作为模板的RNA样品浓度越高，所以4份合并样品RNA浓度从高至低的排列顺序是：B-A-C1-C2。

本实验发现，A、B、C1、C2三种试剂盒提取的RNA，理论上RNA 的OD260/OD280比值为2。在纯度方面均与理论值一致，但是在浓度方面差异显著(P<0.05)。

3 讨论

用试剂盒提取RNA，影响因素很多。RNA提取原理均是利用酶和裂解液将病毒外膜溶解和RNA释放，再利用吸附柱将RNA吸附在其表面，最后用洗脱液洗脱收集。在选择RNA提取试剂盒时，酶的活性、裂解液的质量、吸附柱的吸附效果以及洗脱液的洗脱效率等因素都对PRRSV的RNA提取效果影响很大。另外，PRRSV是单股正链RNA，由于本身化学结构不稳定极易降解，温度和时间都会影响到RNA的提取。在实验操作中，应在低温环境下操作，同时缩短操作时间。

图1 四份合并样品荧光定量RT-PCR 检测结果

综上所述，本实验通过对三种试剂盒提取PRRSV RNA的效果进行比较，发现不同试剂盒对提取RNA有显著性差异。依据A、B、C三种试剂盒提取效果比较，优先推荐B试剂盒。

参考文献：

[1]王赤华，曾勇. 甲型H1N1流感病毒采用不同核酸提取方法的比较研究[J].临床和实验医学杂志，2017，16(03):230-232.

[2]刘建礼，刘翌，王飞，田茵，孙福军，乌日嘎，张绍福，祁晓丽，李岩，周燕楠. 两种核酸提取方法在寨卡病毒实时荧光RT-PCR检测中的比较[J].中国国境卫生检疫杂志，2016，39(03):169-171+179.

[3]范公忍，陈天宝，李冰，胡学玲，曹建彪. 两种核酸提取方法对丙型肝炎病毒RNA检测效果的比较及应用评价[J].检验医学与临床，2015，12(01):48-50.

[4]张险朋，董瑜，温贤诚，徐振娜，殷三鸿，黄炳炽. 三种核酸提取方法检测禽流感病毒的比较[J]. 动物医学进展，2014，35(11):116-119.

[5]何世成，林源，王昌建，刘道新，谭丹，唐小明，王卫国，鲁杏华，邱立新，何玉玲. 五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较[J].中国动物检疫，2014，31(08):70-72+85.

[6]李红艳，张东雷，黄丽英，陈小珍.15种提取液对辣椒粉中3种碱性橙染料提取效果比较[J].食品科技，2012，37(08):297-300.

[7]Gouveia GR, Ferreira SC, Ferreira JE, Siqueira SAC, Pereira J. Comparison of Two Methods of RNA Extraction from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens.BioMed Research International. 2014(2):15-17.

[8]El-Ashram S, Al Nasr I, Suo X. Nucleic acid protocols: Extraction and optimization. Biotechn -ology Reports. 2016(12): 33-39.