清热解毒法体外抑菌作用的实验研究※

邹 文 周 明 侯慧铭 李骏宇 龚 礼

（南昌市洪都中医院骨十科，江西 南昌 330006）

抗菌药物自出现以来，为治疗感染性疾病提供了良好条件，但随着抗生素被广泛和大量地使用，其毒副作用也凸现出来[1]。长时间使用抗生素，可致人体菌群的紊乱，并且产生耐药性，加大了二重感染的几率，重者甚至可导致耳聋等症状的出现。这些危害给治疗带来了难以攻克的难题。作为中医清热解毒的代表方五味消毒饮[2]，五味中药通过中医“君、臣、佐、使”的配伍特点，发挥五味消毒饮的临床功效。这也是应对目前滥用抗菌素所带来的耐药等问题的研究方向，并有巨大的临床意义。对推动我国抗炎免疫药理的发展及寻求更高效、低毒抗炎免疫药物起着重要作用。作为清热解毒的代表方五味消毒饮的临床疗效需要实验室的验证，对进一步了解其药理机制有着十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药液制备 五味消毒饮由金银花30 g，野菊花、紫花地丁、天葵子、蒲公英各12 g组成。炮制方法：煎煮前用蒸饱水浸泡1 h。第1次加入中药质量6倍的水（约450 mL），先武火煮至沸腾，再用文火煎30 min。收集水煎液用纱布过滤药液。再加入4倍量水（约300 mL)，浸泡30 min，先武火煮沸后转为文火煮30 min。收集水煎液用纱布过滤药液。合并2次水煎液。用旋转蒸发器将药液浓缩成20 mL（即每毫升药液含原生药1 g）。在0.1 MPa，120℃条件下灭菌15 min，装瓶置4℃冰箱保存备用；双黄连口服液10支，生理盐水。

1.1.2 供试菌株的准备 供试菌种金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌

1.1.3 培养基制备 营养肉汤：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL。

营养肉汤制法：按上述成分混合，溶解后用4%NaOH调节pH到7.2（用精密pH试纸对照），121℃高压灭菌20 min，备用。

营养琼脂：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化及菌悬液制备 将供试菌株分别接种于培养基中的斜面培养基上活化，经37℃恒温培养箱培养24 h后，分离出典型的单个菌落，然后再转接于肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24 h。取1 mL培养液用生理盐水以10倍稀释法依次进行稀释，选取0.5麦氏浓度的菌液0.1 mL置于培养皿琼脂上，用无菌涂布器轻轻将菌液涂匀，经37℃恒温箱培养24 h后，用无菌生理盐水冲洗菌落，并用无菌生理盐水稀释菌液，与麦氏比色管对比调整其浓度达到0.5麦氏比浊标准(McF)而配成1.5×108cfu/mL密度的菌液。

1.2.2 五味消毒饮药物敏感性测定 本实验采用纸片扩散法 （K-B法）[3]：（1） 纸片制作：实验前1天，选取直径为6 mm，吸水力为20μL的专用药敏纸片，分别浸泡于五味消毒饮、生理盐水中。使之完全浸透，将含药物的纸片密封保存于2～8℃无霜冷冻箱内保存。使用前1～2 h将存储容器移致室温平衡，以避免开启时产生冷凝水。（2）涂布接种：取无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在培养皿表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1周。（3）贴含药纸片：平板在室温下干燥3～5 min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于培养皿表面，纸片距平板内缘应大于15 mm；（4）读取数据：置于37℃恒温箱中培养24 h，观察抑菌圈大小，用游标卡尺测量并记录结果。实验重复3次，取平均值。见图1。

参照《微生物和检验技术》[4]判定结果。结果评判标准为：抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感；抑菌圈直径为10～19mm为中度敏感；抑菌圈直径＜10 mm为低度敏感。

图1 K-B法

1.2.3 最小抑菌浓度测定 本实验采用试管二倍稀释法[5]：测定40支试管分别插入4个试管架中，分成4组，将4个试管架标记好，4组分别为金葡菌组、溶血性链球菌组、大肠杆菌组、绿脓杆菌组。每组10只试管分别置入2.0 mL营养肉汤。从第1管开始加入药液2.0 mL，混匀，连续倍比稀释至第8管，第8管吸出2.0 mL弃去，分别标出1～8号试管的浓度。使药液依次稀释成：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 （即浓度依次为：500.00，250.00，125.00，62.50，31.25，15.63，7.81，3.91原药材mg/mL)。然后，除第9管外，用无菌移液管在其余试管再加入菌悬液100 μL。1～8号试管为实验组 (含营养肉汤、菌液、药液），第9支管为阴性对照组（只含营养肉汤），第10支管为细菌生长阳性对照组（含营养肉汤、菌液）。其中细菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌）在37℃恒温培养箱中培养24 h。培养结束后，将上述试管中的培养液，每支试管中吸取1 mL移种于相应琼脂培养基上，倒置培养，以平皿上菌落数小于阳性对照为五味消毒饮对该菌种的最小抑菌浓度。见图2。

图2 二倍稀释法

2 结果

2.1 供试中药药物敏感性 结果显示金黄色葡萄球菌对五味消毒饮提取液高度敏感，大肠埃希菌、绿脓杆、乙型溶血性链球对五味消毒饮提取液中度敏感。见表1。

表1 五味消毒饮提取液对4种常见菌的抑制结果 （x±s，mm)

2.2 最小抑菌浓度 量取连续倍比稀释的五味消毒饮提取液与稀释菌液恒温培养，玻璃皿涂板测定五味消毒饮提取液对不同菌株的最小抑菌浓度。结果表明，五味消毒饮有效成分中含有抑菌成分。五味消毒饮对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌均有不同程度的抑菌作用，五味消毒饮对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为31.25 mg/mL，对大肠埃希菌的最小抑菌浓度为62.50 mg/mL，对绿脓杆菌的最小抑菌浓度为125 mg/mL，对乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度为125 mg/mL。见表2。

表2 五味消毒饮最小抑菌浓度的测定结果

3 讨论

近些年来，抗菌药物问题已经越来越凸显，全社会越来越多地将焦点放在中医对围手术期抗菌效果的研究上。中医中药学中的清热解毒法在治疗病毒性感染方面有着很好的临床效果，前人也积累了大量的临床经验。而其自身的组方特点和配伍方法，完全不同于西医治疗机理，具有一定的优势和临床价值。

现代药理研究和临床实践证实，中药在临床使用时可以在不破坏组织的原有结构的基础上，发挥抗菌作用，不仅可以直接杀灭病菌，并且能阻止细菌超微结构的复制，最后还可以通过提高人体免疫细胞的识别和吞噬作用，从而阻止人感染病菌，起到双向调节人体免疫系统的作用[6]。这也是中医“扶正不留邪，祛邪勿伤正”治疗特点的体现[7]，由此可见，其药学基础是抗菌作用，这也成为判断中药能否发挥抗菌作用的临床基准。

五味消毒饮作为清热解毒法的代表方，自收载成方的200余年以来，其使用人数、适用范围不断增加，不仅减少了病人的痛苦，也为我们后继者积累了丰富使用经验。进入新世纪以来，人们对于中医科学的呼声不断增高，这要求我们在继续使用好经方五味消毒饮的同时，对其药理机制、配伍特点进行研究，并结合临床疗效的观察，才能更好地发挥五味消毒饮的作用。

[1]游庆霞，赵粉霞.浅谈抗生素的合理使用[J].医学信息，2010，23(1):224-224.

[2]向敏，王建梅，顾瑶华，等.加味五味消毒饮提取物对小鼠角叉菜胶炎症模型的作用[J].中国现代医学杂志，2011，21(12):1462-1465.

[3]谭瑶，赵清，舒为群，等.K-B纸片扩散法药敏试验[J].检验医学与临床，2010，7(20):2290-2291.

[4]郭积燕，王燕梅.第二版《微生物检验技术》教材编写的实践与思考[J].卫生职业教育，2009，27(8):142-143.

[5]何苗，陈红斌，刘衡.改良的MTT 96孔板微量二倍稀释法测定大黄对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用[J].医药前沿，2014(15):186-186.

[6]张思功，田小兰，舒晓明，等.全新认识中性粒细胞在自身免疫病中的致病作用[J].中华风湿病学杂志，2013，17(7)：497-500.

[7]周明，邹文，范少勇，等.仙方活命饮抗炎作用的实验研究[J].中国中医药现代远程教育，2017，15(19):143-145.