沙门菌快速筛选培养基评价方法的研究与应用

张琳韩笑张西萌杨平罗宇文曾静*

（1.河北出入境检验检疫局 河北石家庄 050061；2.北京出入境检验检疫局；3.伯乐生命医学产品（上海）有限公司）

1 前言

沙门菌（Salmonella）是肠杆菌科的重要菌属，也是人类最常见的肠道致病菌之一。人类主要通过食用被污染的食品而导致沙门菌感染，如奶、蛋、肉等[1-3]。此外，接触了携带沙门菌的养殖禽畜、野生动物也有可能导致感染[4-5]。感染沙门菌的患者如果不能得到及时治疗，往往会引发肠穿孔、败血症，最终导致死亡[6-8]。目前，食品中沙门菌的检测方法主要有常规生化鉴定方法、免疫学方法、分子生物学方法等[9-14]，传统培养分离法仍是最常用的鉴定方法。

现行传统检测方法需要4～7 d，分离目的菌所用的培养基包括亚硫酸铋琼（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD），但它们的特异性不强[15-16]，而且存在其他肠道菌群时会影响培养基对沙门菌的检出[17]。鉴于以上问题，一些显色培养基和快速检测方法被不断地开发出来，并成为微生物快速检测技术最有潜力的研究方向之一[18-19]。快速检测方法能减少实验步骤、缩短实验流程、提高检测效率。显色培养基灵敏度高，准确度高。Rapid’Salmonella快速筛选方法是一种新型快速检测方法，在初增菌后用Rapid’Salmonella Agar（以下简称RSA）培养基分离培养，24 h后直接观察结果。出现特征菌落时，用SALMO NELLA LATEX试剂做乳胶凝集试验，进一步确定阳性结果。RSA培养基主要原理：由于培养基中C8酯酶的作用，沙门菌24 h内呈紫红色菌落，β-D葡糖苷酶的应用会使非目标菌呈另外的颜色。RSA培养基既能检测运动性沙门菌也能检测非运动性沙门菌，同时还能检测乳糖实验阳性、硫化氢阴性的沙门菌，包括伤寒沙门菌和乙型副伤寒沙门菌。

本研究采用Rapid’Salmonella快速筛选方法、RSA培养基和SALMONELLA LATEX乳胶凝集试剂，与食品安全国家标准检测方法GB 4789.4-2016[20]从特异性、交叉反应、添加实验、不同批次产品培养条件的影响实验、实际样品的测定和乳清凝集实验等方面进行了方法评价及应用研究。对所得出的结果进行统计学分析，判断其快速方法、显色培养基和乳胶凝集试剂是否具有快速、准确、灵敏且特异性高的能力。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌株

沙门菌参考菌株17株，其中1株猪霍乱沙门菌（S.choleraesuis）CGMCC1.1859购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 （China General Microbiological Culture Collection Center），其余16株均购自中国医学细菌保藏管理中心（National Center For Medical Culture Collections），沙门菌分离株 32株，为本实验室从2005—2012年保存菌株（表1）；非目标菌30 株（表2）。

2.1.2 培养基和试剂

Rapid’Salmonella 沙门菌显色培养基、Rapid’Salmonella Capsule沙门菌增菌添加胶囊和SALMO NELLA LATEX购自法国伯乐公司；脑心浸液（BHI）肉汤和平板培养基、GN鉴定卡购自法国梅里埃生物技术有限公司；缓冲蛋白胨水（BPW）购自英国OXOID公司；木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、亚硫酸铋（BS）琼脂购自法国BD公司；亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、四硫磺酸钠煌绿（TTB）基础、碘液、0.1%煌绿购自北京陆桥科技有限公司。

2.1.3 样品

本实验样品均购自北京京客隆超市，食品类型包括以下几种，肉类：羊肉片、牛肉片、猪肉馅、鸡心、香肠；海产：皮皮虾、秋刀鱼、鳝鱼、大闸蟹、牡蛎肉；蛋类和蛋制品：鸡蛋、蛋黄酱、卤蛋；乳制品：酸奶、冰淇淋、巴氏消毒奶、奶粉；饮料：喜乐；粮谷类：小米面、玉米渣；调料类：五香粉；速冻米面制品：速冻饺子；蔬菜：黄瓜。

2.2 仪器与设备

恒温培养箱FC222（德国MMM）；全温振荡器HZ-C-1（培英公司）；标准比浊仪、VITEK-2 compact（法国梅里埃生物技术有限公司）。

2.3 方法

2.3.1 菌株确认和特异性试验

取冻藏保存于-80℃的49株沙门菌划线接种于BHI琼脂平板上，37℃培养24 h，连续传代2次，选取单菌落进行后续试验。2个实验同时进行。

（1）菌株确认实验：将活化的菌株接种到XLD培养基上，翻转培养37℃，24 h后，观察菌落颜色，并用VITEK-2进行鉴定。

（2）特异性实验：将活化的菌株划线接种到RSA培养基上，翻转培养37℃，24 h后，观察菌落颜色，对显色异常的菌株进行生化实验确认。

2.3.2 乳胶凝集试验

49株沙门菌的阳性结果确定采用SALMONELLA LATEX试剂做乳胶凝集实验，每株菌做3个平行实验。沙门菌成阳性反应。

（1）操作步骤：取 10 μL SALMONELLA LATEX试剂，滴加在试剂盒配套的黑色背景纸。用无菌接菌针在BHI培养基上挑取单个菌落，并在背景纸上与试剂混匀。将黑色背景纸倾斜摇动混合1 min，然后进行观察，是否产生凝集反应。

（2）结果判定：参照何启盖等[21]关于乳胶凝集试验的判定方法进行，全部乳胶凝集为颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明，“＋＋＋”；大部分乳胶凝集为颗粒明显，液体稍有混浊，“＋＋”；约50%乳胶凝集为颗粒较细，液体较混浊，“＋”；液滴呈原有的均匀乳状为“-”。被检抗原凝集阳性者为出现“＋”及以上。

（3）乳胶抗体自凝性检测：取灭菌的生理盐水2滴滴于黑色背景纸上，再滴10 μL SALMONELLA LATEX试剂，用无菌接菌环混匀。结果无凝集现象，表明乳胶抗体无自凝性。

2.3.3 交叉反应试验

取冻藏保存于-80℃的30株非目标菌沙门菌划线接种于BHI琼脂平板上，于36℃培养24 h。分区划在RSA培养基上，翻转培养37℃，24 h后，观察各个平板上生长的菌落。

2.3.4 添加试验

目标菌：鼠伤寒沙门菌 CMCC 50115，干扰菌：大肠埃希菌ATCC 25922。

将目标菌和干扰菌在BHI平板上活化，单个菌落接种于10 mL BHI液体培养基中，36℃，200 rpm摇床培养24 h。培养液用灭菌生理盐水进行梯度稀释，将目标菌稀释到10-7和10-8，菌液浓度分别为340 CFU/mL和36 CFU/mL；干扰菌添加浓度为2.8×106CFU/mL。按照GB 4789.4-2016方法和Rapid’Salmonella快速筛选方法进行实验。

Rapid’Salmonella快速筛选方法操作流程：无菌操作称取25 g样品，高压灭菌样品以确保样品中不含目标菌。用BPW试剂按照1∶9的比例稀释样品，无菌操作加入一个Rapid’Salmonella Capsule胶囊，加入目标菌和干扰菌菌液各1 mL，均质样品。于41.5℃培养18 h后，用接种环取10 μL增菌液，划线接种于RSA培养基，翻转培养37℃，24 h。观察各个平板上生长的菌落。选择具有代表性的5大类食品样品进行添加试验：奶制品类、蛋制品类、粮食类、水产类、肉类，每类样品进行3个平行实验。

2.3.5 培养条件试验

将1 mL目标菌菌液添加到基质中，此为单一菌株添加。添加基质是经高压灭菌处理后的麦片，以保证基质不含有目的菌。按照GB 4789.4-2016和Rapid’Salmonella快速筛选方法进行实验。温度、时间 组 合 为 42.5℃，16 h；42.5℃，20 h；40.5℃ ，16 h，40.5℃，20 h。每个组合进行2个浓度添加，菌液浓度分别为340 CFU/mL和36 CFU/mL，每个浓度进行3个平行实验。

2.3.6 实际样品试验

（1）将2.1.3中的样品分别用GB 4789.4-2016方法和Rapid’Salmonella快速筛选方法进行实验。每个样品、每种方法做5个平行实验，2种方法共计进行230个实验。

（2）针对检出阳性菌的实际样品，重新取样10份，分别用GB 4789.4-2016方法和Rapid’Salmonella快速筛选方法进行实验。每份样品、每种方法做5个平行实验，2种方法共计进行100个实验。在采用GB 4789.4-2016方法进行检验的同时，将RSA培养基与XLD培养基和BS培养基一起使用。

2.3.7 统计学处理

Excel建立数据库，用SPSS 19.0对实验所得出的数据进行统计学分析，2种方法之间检出率的比较采用χ2检验。

3 结果与分析

3.1 菌株确认和特异性试验

（1）菌株确认实验：典型的沙门菌落在XLD琼脂上呈粉红色，带或不带黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色，带或不带黑色中心；菌落直径2～4 mm，大小均匀。49株菌经鉴定均为沙门菌。经VITEK-2进行鉴定后，49株菌均为沙门菌。

（2）特异性实验：典型的沙门菌落在RSA培养基上呈圆形菌落，紫红色，颜色较深，菌落直径2～4 mm，大小均匀。49株沙门菌实验结果见表1。17株参比菌株和32株分离株在RSA培养基上均呈现典型菌落形态（图1），RSA培养基具有良好的特异性，准确率达到100%。

表1 RSA培养基特异性实验及乳胶凝集实验结果

（续表1）

图1 RSA培养基上沙门菌

3.2 乳胶凝集试验

49株沙门菌凝集实验结果见表1。17株参考菌株中，除阿德莱德沙门菌外，其他参考菌株均为凝集试验阳性反应。32株分离株中有3株沙门菌凝集试验呈现阴性反应见图2。对BJ-Sal-55、BJ-Sal-85、BJ-Sal-90这3株分离株使用VIDAS进行进一步的鉴定，结果显示这3株菌是沙门菌。实验得出：SALMONELLA LATEX试剂在乳胶凝集实验中，对沙门菌的阳性菌检出率为91%。

3.3 交叉反应试验

30株非目标菌中弗氏柠檬酸杆菌、粪链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌在RSA培养基上无生长；阪崎杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌在RSA培养基上呈现深蓝色菌落，大肠杆菌和大肠埃希菌呈现浅粉色菌落，志贺菌呈现浅粉色或浅灰色菌落（表2）。实验得出：RSA培养基具有非常好的分辨力。与其他非沙门菌的菌株不存在交叉反应。

表2 RSA培养基交叉反应实验结果

3.4 添加试验

60份实验样品中，在干扰菌的添加量远高于目标菌情况下，结果表明：GB 4789.4—2016方法和Rapid’Salmonella方法在2个添加水平的阳性菌检出率一致，均为100%检出（表3）。

表3 添加实验结果

3.5 培养条件试验

在添加目标菌浓度为36 CFU/mL和340 CFU/mL的水平下，培养温度在41.5℃基础上变化1℃，培养时间在18 h基础上变化2 h的情况下，对Rapid’Salmonella快速筛选方法的阳性菌检出率没有影响。实验结果见表4所示。

表4 培养条件实验结果

3.6 实际样品试验

230份实际样品中，GB 4789.4—2016方法检验2份“鸡心”样品为阳性菌检出（表5），阳性菌检出率为1.7%，Rapid’Salmonella快速筛选方法未检出；其余所有实际检测样品中2种检测方法均为未检出。

表5 实际样品2种方法检测结果

3.7 统计学处理

GB 4789.4—2016方法阳性菌检出率为1.7%，Rapid’Salmonella快速筛选方法未检出。χ2检验结果表明，GB 4789.4—2016 方法和 Rapid’Salmonella快速筛选方法结果差异存在统计学意义（χ2=2.018，P<0.05）。

4 讨论

在乳胶凝集实验中发现，有1株参比菌株阿德莱德沙门菌和3株经鉴定是沙门菌的分离株凝集实验为阴性反应。此结果表明SALMONELLA LATEX试剂检测准确率达到91%。参比菌株阿德莱德沙门菌血清分型为A到F群以外其他群，不凝集原因可能是受到SALMONELLA LATEX试剂中所选的血清分型的限制[22-23]，3株分离株不凝集原因可能与所选菌株长期冻存所导致部分抗原缺失有关[24]，也可能是受到SALMONELLA LATEX试剂中所选的血清分型的限制。

在实际样品实验中，Rapid’Salmonella快速筛选方法的阳性菌检出率低于GB 4789.4—2016方法。此情况的出现可能是由于以下几点原因，首先，GB 4789.4—2016方法是两步增菌，第一次增菌是用BPW增菌液，该增菌液可使加工受损伤的菌体充分复苏，二次增菌液是具有强选择性的TTB和SC这两种增菌液，可抑制非目标菌的生长[25]；而Rapid’Salmonella快速筛选方法是一步增菌，在BPW增菌液中加入1个含有选择性增菌剂和赋形剂的胶囊，抑制了大多数非目标菌的生长，同时可能对目标菌存在一定的抑制作用。其次，GB 4789.4—2016方法选择2种分离培养基，通常是XLD和BS培养基，而Rapid’Salmonella快速筛选方法只选择1种分离培养基，可能会影响该方法的检出率。但是，当RSA培养基作为一种选择性培养基与XLD培养基和BS培养基一起使用时，其检出率远远好于BS培养基，仅次于XLD培养基（数据未展示）。而且其培养基显色明显，便于区分目标菌和非目标菌。

RSA培养基具有很好的特异性和选择性，可以作为一种选择性培养基来使用。使用SALMONELLA LATEX试剂做乳胶凝集实验操作简单且节省时间，可以作为一种快速的初筛方法，有凝集反应的菌株可以判断为阳性结果，阴性结果的菌株需要用其他方法做进一步验证。Rapid’Salmonella快速筛选方法操作上比国标GB 4789.4—2016方法简便，是一种有助于缩短致病菌检测时间的方法，可用于辅助国标GB 4789.4—2016方法应用于食品检测中。

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