小麦面筋蛋白去酰胺与磷酸化改性的研究

张玲玲，李永祥

（天津科技大学新农村发展研究院，食品工程与生物技术学院，天津 300457）

小麦是仅次于玉米的世界上第二大粮食作物，几乎全部经过深加工成为淀粉后用于食用，在这个过程中会产生大量的副产物，小麦面筋蛋白就是其中之一。因为小麦面筋蛋白具有优良的延展性、黏弹性、薄膜成型性等物理特性，常作为烘焙食品的添加剂使用[1]。然而，因为小麦面筋蛋白中的疏水氨基酸较多，溶解性较低，使得它的乳化性、起泡性、持水吸油性等性质都不理想，最终限制了其在食品加工领域的应用，所以通过对小麦面筋蛋白进行改性以期得到功能性质更好的蛋白质。

植物蛋白的改性方法有物理改性、化学改性、酶法改性和基因工程改性等[2]。物理改性是通过适度的热变性、添加增稠剂、机械处理、挤压、冷冻、质构化和超声波等方式改变蛋白质的高级结构和分子间的聚集方式，从而改善植物蛋白的功能性和营养特性，但对设备要求较高，且较难展开大规模工业化应用生产[3]。酶法改性虽反应条件温和，但专一性强，需要一定的前处理，反应速度较化学方法慢得多，生产周期长且成本昂贵，故在食品中的应用仍不多[4]。基因工程技术周期长、见效慢，目前仍处于实验室阶段，尚未在生产中应用[5]。化学改性反应时间短、成本低，对设备要求不高，且改性效果明显，因此化学改性仍然是蛋白质改性的主流方向[6]。Matheis G等人[7]认为利用三聚磷酸钠对蛋白质的改性是安全可行的，它不但改善了蛋白质的功能特性，而且不会影响蛋白质在体内的消化率。唐文婷等人[8]指出利用三聚磷酸钠对蛋白质的改性可以很好地提高蛋白质的水溶性、起泡性等。因此，选择去酰胺与磷酸化复合改性的方法对小麦面筋蛋白进行改性，以提高其功能性质，扩大其应用领域。改性后的小麦面筋蛋白可作为脂肪模拟物应用于运动饮料、婴幼儿奶粉、脂肪模拟物等食品中替代部分甚至全部脂肪[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦面筋蛋白（食品级），河南润诚化工产品有限公司提供；醋酸、三氯乙酸（分析纯），天津市化学试剂一厂提供；多聚磷酸钠、磷酸氢二、磷酸二氢钠（分析纯），天津市北方天医化学试剂厂提供；大豆色拉油（食品级），嘉里粮油（天津）有限公司提供；十二烷基磺酸钠（分析纯），天津市佳兴化工有限公司提供。

高温立式杀菌锅，上海申安医疗器械厂产品；Evolution300型紫外-可见分光光度计，Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 去酰胺与磷酸化改性小麦面筋蛋白的制备方法

称取一定量的小麦面筋蛋白溶于0.082 mol/L的醋酸溶液中，配成10%（W/V）的小麦面筋蛋白悬浮液，将其置于水浴锅中于25℃条件下水化2 h，将得到的样品悬浮液于121℃灭菌锅中湿热处理15 min，（待杀菌锅预热到近100℃时放入样品），然后快速放气，取出样品后立即冰浴冷却停止反应[10]。

用1 mol/L NaOH和0.5 mol/L HCl溶液调节pH值，磁力加热搅拌时分批等量加入一定量的多聚磷酸钠，反应过程中用NaOH和HCl调节pH值，维持在加入多聚磷酸钠前的固定值，维持温度恒定。反应结束后冷却，调节反应溶液pH值为7.0，于4℃条件下透析24 h，以转速3 000 r/min离心10 min后去上清液，冷冻干燥，粉碎保存。

1.2.2 磷酸化程度的测定方法

采用EDTA滴定法：①用移液枪移取磷酸化反应结束后的上清液5 mL于离心管中，加入过量的10%的三氯乙酸溶液于离心管中用于沉淀蛋白质（约20mL），在高速离心机上以转速4 500 r/min离心5 min；②将上清液倒出，给上清液中加入过量的醋酸锌固体（约0.5 g），同时用1 mol/L的NaOH调节上清液的pH值在3.8～3.9，会有大量的絮状沉淀出现，沉淀主要是焦磷酸锌，在高速离心机上以转速4 500 r/min离心5 min；③将离心获得的沉淀用氨缓冲溶液（pH值10） 溶解（约30 mL）；④用0.01 mol/L的EDTA标准溶液滴定Zn2+，用铬黑T作为指示剂，当溶液由酒红色变为蓝色时即为滴定的终点；⑤用所用的EDTA的体积表示磷酸化的程度大小。

1.2.3 小麦面筋蛋白乳化性及其乳化稳定性的测定[11]

取30 mL质量分数为0.4%（W/V） 的蛋白溶液（溶于0.01 mol/L，pH值7的磷酸盐缓冲液）和10 mL玉米油，用均质机以转速20 000 r/min，温度20℃的条件下均质1 min。用移液枪迅速从底部吸取500 μL溶液，用配制好的0.1%SDS溶液将其定容至50 mL，于波长500 nm处测定其吸光度A0，静置10 min后，根据上述同样操作再次取样，测定吸光度At。以SDS溶液为空白，做3个平行。

以乳化活力指数EAI表示：

式中：EAI——每克蛋白质的乳化面积，m2/g；

N——稀释倍数；

A0——500 nm下0时刻的吸光度；

L——比色池光径（1 cm）；

φ——体系中油相所占的分数，试验中油相占0.25；

C——蛋白质的质量浓度，g/mL。

乳化稳定性用乳化稳定指数表示：

式中：A0——0时刻的吸光度；

At——t时刻的吸光度；

ΔT——时间差，10 min。

1.2.4 小麦面筋蛋白起泡性及其起泡稳定性的测定

取70 mL质量分数为0.2%（W/V） 的蛋白溶液（溶于0.01 mol/L，pH值7的磷酸盐缓冲液）于100 mL离心管中，用均质机在转速20 000 r/min，温度20℃条件下均值1 min，立刻倒入量筒中，记录泡沫体积V0。于30 min后记录体积V30。计算其起泡性和泡沫稳定性。起泡性计算公式如下：

式中：V0——均质后体积，mL；

V——取样体积，mL。

起泡稳定性计算公式如下：

式中：V30——静置30 min后体积，mL；

V0——均质后体积，mL；

V——取样体积，mL。

1.2.5 小麦面筋蛋白持水性及吸油性的测定

称取0.1 g的改性后的蛋白质样品于离心管中，加入适量的水（大豆色拉油） 将样品完全浸泡，然后用漩涡混合器振荡1 min，用高速离心机以转速5 000 r/min离心10 min，取出后去上清液，称质量。则持水（吸油）性的计算公式如下：

式中：m0——WGP样品的质量，g；

m1——样品加离心管的质量，g；

m2——离心后离心管加沉淀的质量，g。

1.2.6 小麦面筋蛋白的傅里叶红外光谱测定

准确称量1 mg样品与150 mg干燥的溴化钾，用玛瑙研钵将其充分研磨至细末贴壁，颗粒直径2 μm左右。使用压片机将混合粉末压制成透明薄片，用红外光谱仪做全波段扫描（4 000～400 cm-1），扫描次数为16次，分辨率为4%，以空气为采集背景，样品红外光谱图经过傅立叶变换得到。

2 结果与讨论

2.1 未改性小麦面筋蛋白功能性质的测定结果

对未改性小麦面筋蛋白的功能与性质进行测定和分析。

未改性与去酰胺小麦面筋蛋白功能性质的测定结果见表1。

表1 未改性与去酰胺小麦面筋蛋白功能性质的测定结果

由表1可知，未改性小麦面筋蛋白的起泡性、乳化性等功能特性都相对较差，这就限制了其在食品工业中的应用。去酰胺改性后，小麦面筋蛋白的乳化性、乳化稳定性、起泡性、起泡稳定性、持水和吸油性都有明显的提高[11]。然而，经过去酰胺改性后的小麦面筋蛋白溶于水之后依旧呈现一种面筋状，因此对于去酰胺小麦面筋蛋白进行磷酸化改性考查其功能性质。

2.2 磷酸化改性小麦面筋蛋白的研究

在磷酸化改性的过程中，选择反应时间、反应pH值、反应温度和磷酸化试剂的添加量进行单因素试验，每组单因素选择5个梯度进行试验。

2.2.1 反应时间对磷酸化改性的影响

反应pH值9.0，反应温度25℃，磷酸化试剂添加量15%（多聚磷酸钠质量/小麦面筋蛋白质量），考查反应时间为10，20，30，40，50 min时对小麦面筋蛋白磷酸化改性的影响。选择5个时间点，通过5个时间梯度EDTA的用量来确定磷酸化的程度，以此来判断什么时间磷酸化的程度最高、反应最彻底。

反应时间对小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响见图1。

图1 反应时间对小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响

由图1可知，在加入磷酸化试剂的0～30 min内，反应时间越长反应越彻底；当反应时间超过30 min时，磷酸化反应程度反而减低；达到40 min时，反应趋于稳定。由此，反应时间在30 min时磷酸化程度最大、反应最彻底。

反应时间对复合改性产物功能性质的影响见表2。

表2 反应时间对复合改性产物功能性质的影响

由表2可知，在30 min之前，随着反应时间的延长，产物的乳化性、乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性均逐渐增强，超过30 min后，功能性质均逐渐下降，这与磷酸化反应程度的变化相一致。所以最佳反应时间是30 min。且通过比较复合改性和去酰胺改性后蛋白质的功能性质发现，复合改性的乳化性、乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性均有所提高，且复合改性后的产物溶于水之后不会有面筋形成。

2.2.2 反应pH值对磷酸化改性的影响

反应时间40 min，反应温度25℃，磷酸化试剂添加量15%，考查反应pH值为5，7，9，11，13时对小麦面筋蛋白磷酸化改性的影响。

反应pH值对小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响见图2。

图2 反应pH值对小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响

由图2可知，反应pH值在5～9时，磷酸化程度先降低后升高，反应pH值在11～13时，磷酸化程度明显降低，当反应pH值为9时磷酸化程度达到最大，推测蛋白质在碱性较大的情况下会发生变性，从而影响磷酸化，使蛋白质的磷酸化程度降低[12]。

反应pH值对小麦面筋蛋白复合改性功能性质的影响见表3。

当反应pH值为9时，其乳化性、起泡性相比其他反应pH值较高，虽然反应pH值为13时乳化和起泡性均较高，但是碱性太大、蛋白质容易变性，所以选择pH值9为最佳改性条件。

2.2.3 反应温度对磷酸化改性的影响

反应时间40 min，反应pH值9，磷酸化试剂添加量15%，考查反应温度为25，35，45，55，65℃时对小麦面筋蛋白磷酸化改性的影响。

表3 反应pH值对小麦面筋蛋白复合改性功能性质的影响

反应温度对于小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响见图3。

图3 反应温度对于小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响

随着反应温度的升高，磷酸化程度逐渐增大，当反应温度达到45℃时磷酸化程度最高，当反应温度超过45℃时磷酸化程度迅速下降。

反应温度对小麦面筋蛋白复合改性功能性质的影响见表4。

表4 反应温度对小麦面筋蛋白复合改性功能性质的影响

在反应温度为45℃时产物的乳化性、乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性最好。因此，最佳反应温度为45℃。

2.2.4 磷酸化试剂添加量对磷酸化改性的影响

反应时间40 min，反应pH值9，反应温度25℃，考查磷酸化试剂添加量为5%，10%，15%，20%，25%时对小麦面筋蛋白磷酸化改性的影响。

磷酸化试剂添加量对于小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响见图4。

随着磷酸化试剂添加量的增多，磷酸化的程度逐渐变大，当磷酸化试剂添加量达到25%时磷酸化程度最大，再增加磷酸化试剂添加量，磷酸化程度逐渐趋于稳定甚至有所下降，可能是大量的多聚磷酸钠使溶液浓度增大，抑制反应发生。

磷酸化试剂添加量对小麦面筋蛋白复合改性功能性质的影响见表5。

图4 磷酸化试剂添加量对于小麦面筋蛋白磷酸化程度的影响

表5 磷酸化试剂量对小麦面筋蛋白复合改性功能性质的影响

随着磷酸化程度的加大，小麦面筋蛋白的功能性质均有所提高，当磷酸化试剂添加量达到25%时，功能性质达到最大，因此最佳磷酸化试剂添加量为25%。

通过单因素试验可知，去酰胺小麦面筋蛋白磷酸化改性的最佳条件为反应时间30 min，反应pH值9，反应温度45℃，磷酸化试剂添加量25%。

2.3 小麦面筋蛋白前后的红外分析

未改性小麦面筋蛋白的红外光谱见图5，去酰胺改性小麦面筋蛋白的红外光谱见图6，复合改性小麦面筋蛋白的红外光谱见图7。

图5 未改性小麦面筋蛋白的红外光谱图

由图2～图5可知，3 301 cm-1附近的特征吸收峰为N-H的伸缩振动吸收带，1 657 cm-1附近的特征吸收峰为酰胺基团上C=O键的伸缩振动；1 537 cm-1附近的特征吸收峰为N-H键的弯曲振动；1 450 cm-1附近的特征吸收峰为C-N伸缩振动。这些均为小麦面筋蛋白红外光谱图的特征吸收谱[13]。由图6可知，3 284 cm-1附近的特征吸收峰为羧基上-OH的弯曲振动，1 654 cm-1附近的特征吸收峰为羧基上C=O键的伸缩振动。1 312 cm-1附近的特征吸收峰为C-O单键的伸缩振动[14]。由图5和图6中可知，3 301 cm-1和1 657 cm-1附近吸收峰的变化说明有部分的酰胺基团在去酰胺改性后变成了羧基。由图7可知，由于蛋白质中的侧链-OH、-NH2上连接了磷酸基团。所以，在1 073 cm-1和1 035 cm-1处出现氨基酸-PO32-和氨基酸-P-O-C的明显吸收峰[15]。同时，在3 800 cm-1和2 900 cm-1处的裂分减少，可能是因为蛋白质中的-OH，-NH2因磷酸根离子替代而消失。

图6 去酰胺改性小麦面筋蛋白的红外光谱图

图7 复合改性小麦面筋蛋白的红外光谱图

3 结论

对小麦面筋蛋白进行磷酸化改性的单因素试验，得出改性的最佳条件为反应温度45℃，反应pH值9，反应时间30 min，多聚磷酸钠添加量25%。红外谱图分析也验证了改性确实成功了。对改性前后的小麦面筋蛋白进行功能性质的测定，发现去酰胺与磷酸化复合改性后的小麦面筋蛋白的功能性质比未改性和去酰胺改性的小麦面筋蛋白的功能性质均提高不少，这无疑是一个变废为宝的过程，日后可将其添加到运动饮料中，可直接补充蛋白质，添加到老年人的保健品中可平衡饮食结构等。

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